一、拉曼光譜技術在細菌研究方面的主要應用類型

       細菌存在于生活的方方面面，醫學、農業、環境、食品、考古等多領域均將其作為重要研究內容之一。拉曼光譜是一種指紋光譜技術，能夠快速獲取樣品的化學結構信息。因此能夠被應用于細菌分類、細菌篩選、細菌耐藥性、細菌分泌物等研究。

1、細菌分類和細菌篩選

       拉曼對細菌分類很好理解，不同細菌具有不同的細胞結構和成分，拉曼光譜能夠區分出細菌組成的化學類型或其含量比例的不同。一般情況下，細菌的結構很類似，肉眼難以直接判斷其類型，需要借助化學計量學對其進行分析，即可實現快速細菌分類。相對于傳統方法需要培養數天細菌再進行鑒別，此方法效率提高數十倍。

                     

                       Identification of bacteria in drinking water with Raman spectroscopy，Anal. Methods, 2013

                       當我們將各類細菌的拉曼光譜建立成數據庫，利用拉曼+光鑷+微流控協同體系，即可進行細菌的但單細胞篩選。

                  

                     Raman-Activated Cell Sorting Based on Dielectrophoretic Single-Cell Trap and Release.nal. Chem. 2015

                     Label-free, rapid and quantitative phenotyping of stress response in E. colivia ramanome，Scientific RepoRts ,2016

       不同細菌、相同細菌在不同發育時期，其化學結構及其含量比例，由此可延申研究細菌生長發育分期、外部環境誘導細菌分化等各類研究，在此不一一贅述。

2、細菌耐藥性

       利用拉曼技術篩選有效藥物是目前（成）熟和（有）效的拉曼-細菌應用類型。通過給細菌飼喂帶有氘原的葡萄糖營養液，如果細菌耐藥，則氘原子代謝到細菌細胞中，在2200cm-1處出現明顯的D-O峰，區別于H-O鍵，此范圍屬于俗稱的拉曼靜默區，能夠很靈敏的判別。利用這一技術，不到1小時即能夠判斷藥物對細菌是否有致死作用。

                

                  Rapid Antibiotic Susceptibility Testing of Pathogenic Bacteria Using Heavy-Water-Labeled Single-Cell Raman Spectroscopy in Clinical Samples，Anal. Chem. 2019

二、細菌研究對拉曼光譜儀設備有哪些主要要求？

       從上面的內容得知，拉曼研究細菌具有非常好的辨識度，成熟可靠，那么是不是任何一臺拉曼都能夠用于細菌測量呢？答案是否定的。那么細菌研究對拉曼選擇有哪些核心要求呢，我們分析細菌研究的特點后即可豁然開朗。

1、細菌尺寸很小。多數細菌的尺寸在10-100微米范圍內，部分細菌可小至2微米升值1微米以下。由此對拉曼的首要需求——小聚焦光斑。因此要求拉曼光譜儀要對激發光束進行整形、同時盡可能選擇高倍物鏡，以達到將聚焦光斑控制在細菌體積范圍內。如下右圖為我司研發的DeepBlue系列共聚焦拉曼光譜系統的聚焦光斑實測圖像，100倍物鏡聚焦光斑<1微米。小的聚焦光斑還具有的另一個優勢：即激光功率密度大，拉曼激發效率高，也保證了系統的靈敏度。這也就解釋了很難看到手持式或光纖探頭拉曼能夠對單細胞的細菌進行測試。

                 

                             左圖來自于網絡，如有侵權請聯系作者刪除。

2、細菌多數是光學透明的。光學透明意味著拉曼的激發光很容易穿透細菌并照射到細菌的培養皿，則培養皿的拉曼信號容易干擾細菌拉曼測試。這種特點對拉曼光譜儀的Z軸的共聚焦性能也提出了更高的要求。通過減小針孔尺寸壓制聚焦光斑以外的拉曼信號，獲得高信噪比拉曼光譜數據。

3、細菌體系可能帶有熒光。細菌作為生物體會包含熒光特性的氨基酸（如色氨酸等）或其他熒光分泌物，另一方面，培養基材料的類別或純度也很有可能帶入熒光。因此選擇合適的激發波長也是非常關鍵的一環。如果細菌體系無熒光，優選532nm等短波長激發，測試信號強，測試速度也快。如果確有熒光則需要選擇785nm或1064nm等長波激發，或針對研究體系選擇專門的激發波長，避開熒光干擾（如下示意圖）。

                

                     上圖為示意圖，不適合所有類型樣品，熒光特性由樣品本身決定，需要進行單獨考察

4、其他因素。拉曼系統的通光效率、雜散光抑制能力，光譜分辨率、探測器溫度，光譜測量范圍等因素也會影響到細菌測量。其中通光效率+雜散光抑制能力=系統的靈敏度更為重要，直接影響了測試結果是否可用。系統靈敏度另外闡述，此文暫不涉及。

三、DeepBLUE200共聚焦顯微拉曼光譜儀細菌樣品實測效果

       1、樣品來源：成都生物所

       2、樣品種類：大腸桿菌？

       3、樣品數量：2

       4、測試條件：

  注：本次測試設備部件均為國產，光譜儀更換為進口型號，效果更好。

       5、樣品處理辦法和測量過程:

            5.1 用鑷子將培養皿中的樣品挑取到中空金屬支架上，使測試區域懸空；

            5.2 白光反射照明+CCD相機+10X物鏡尋找和觀察目標細菌；

            5.3 切換至100X物鏡，聚焦清晰；

            5.2 點擊控制器，白光制動切換至激光光路，激光照射到樣品上，開始測量；

       6、測試結果

            

        以上獲得了清晰的細菌拉曼光譜數據，兩種細菌區分有明顯的拉曼峰位，達到了用戶目標要求。相對用戶此前采用本單位拉曼測試結果（如下兩圖），DeepBlue200的效果非常明顯。

                    

                      細菌1（明顯的背景信號，無細菌拉曼信號）

                       

                     細菌2（明顯的培養皿塑料拉曼信號，無細菌信號）

四、儀器推薦

                   

      DeepBlue200是一款高性能全自動激光共聚焦顯微拉曼成像光譜儀，用于固體液體樣品的拉曼光譜測量，用于體相材料的拉曼光譜掃描成像。特點如下：

      自動化：自動切換白光/激光光路，自動切換激發波長、自動選擇激光功率。

      高靈敏：真共焦設計，極簡光路，高雜散光抑制能力無懼硅三階峰信噪比挑戰，直面激光不耐受和拉曼信號弱等難測樣品的考驗，如薄膜、小顆粒和稀溶液樣品。

      穩定性：主要力學結構件和光機部件均采用高強度合金材料，結構力學重心下移光學部件剛性耦合，儀器具有極（佳）的穩定性，抗環境擾動能力強。

      靈活性：DeepBlue200可采用全國產光學部件，為用戶提供低成本高性能解決方案，滿足大多數用戶需求；DeepBlue200也可集成HORIBA光譜儀和XYZ掃描平臺，實現高光譜分辨率、高空間分辨率和大樣本自動分析等高級功能。