為探究代謝狀態對肝細胞脂毒性敏感性的影響，研究在MCS正常培養基與MCD代謝紊亂培養基中，分別用LA-m、LA-l單獨或聯合處理AML12、HepG2細胞及小鼠原代肝細胞。結果顯示，MCS條件下，兩種脂肪酸單獨或聯用均未顯著改變AML12細胞活力（圖1A、1B）；MCD條件下，單獨脂肪酸無明顯影響，但LA-m與LA-l聯用顯著降低細胞活力。在HepG2細胞（圖1C、1D）與小鼠原代肝細胞（圖1E-1G）中均得到一致結果。綜上，MCD培養基誘導的代謝紊亂使肝細胞對LA-m與LA-l聯合暴露誘導的毒性更敏感。

肝臟類器官先經擴增與分化培養（圖2A），免疫熒光結果顯示，肝細胞特征標志物HNF4α在細胞核高表達，成熟轉運體MRP2正確定位于類器官外緣，證明類器官分化成熟（圖2B）。將成熟類器官分別置于MCS與MCD培養基中給予脂肪酸處理，結果如圖2C、2D所示：MCS條件下，LA-m、LA-l單獨或聯用均不影響類器官活力；MCD條件下，二者聯用顯著降低細胞活力。該結果為人源代謝紊亂狀態下LA-m與LA-l聯合暴露誘發肝毒性提供了更具臨床相關性的證據。

圖3. 月桂酸與亞油酸聯合可加重MCD飲食誘導的肝臟脂肪變性與肝毒性，但對正常飲食小鼠無影響。正常飲食（ND）組：(A)正常飲食小鼠實驗設計示意圖。(B)實驗期間隔日測定小鼠體重。(C)平均攝食量。(D–G)實驗結束時肝臟甘油三酯（TG）、肝臟非酯化脂肪酸（NEFA）、血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平。(H,I)肝臟組織H&E染色（H）與油紅O染色（I）；放大倍數×200；標尺：100 μm。MCD飲食組：(J)MCD飲食小鼠實驗設計示意圖。(K)3周內隔日測定小鼠體重。(L)平均攝食量。(M–P)實驗結束時肝臟TG、肝臟NEFA、血清ALT、AST水平。(Q–T)肝臟組織H&E染色（Q）與肝臟NAS評分（R）；油紅O染色（S）與肝臟脂質陽性面積（T）；放大倍數×200；標尺：100 μm。

4. 肝臟脂質代謝紊亂參與LA-m與LA-l聯合暴露加劇的肝毒性

為解析LA-m與LA-l組合誘導肝毒性的機制，該研究采用基于液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）的脂質組學技術，檢測健康或MCD飲食誘導的MASH狀態下，單一脂肪酸或二者組合誘導的脂質代謝變化，結果顯示PCA可清晰區分正常飲食與MCD飲食小鼠的脂質分布（圖4A），模型穩定有效。MCD飲食本身顯著升高肝臟TG（圖4B），在此基礎上，LA-m與LA-l聯用進一步增加TG種類與含量（圖4C、4D），同時顯著升高鞘脂（Cer、SM）與甘油磷脂（PC、PI、PS、PE）水平（圖4E-4J），且PE中富集AA與AdA側鏈（圖4K），綜上，MCD飲食誘導的MASH狀態下，LA-m與LA-l聯合干預可顯著擾亂肝臟脂質代謝，可能參與該組合誘導的肝毒性。

圖4. 月桂酸與亞油酸聯合可誘導MCD飲食小鼠肝臟甘油三酯、鞘脂與甘油磷脂蓄積，進而加重肝毒性。(A–K)LA-m與LA-l聯合對肝臟磷脂的影響。小鼠經LA-m（350 mg/kg）、LA-l（1000 mg/kg）單獨或聯合處理3周，采用液相色譜串聯質譜（LCMS/MS）分析脂質組成。(A)正常飲食與MCD飲食小鼠肝臟脂質分布的主成分分析（PCA）。(B)熱圖顯示MCD飲食小鼠較MCS飲食小鼠甘油三酯（TG）倍數變化。(C)熱圖顯示LA-m、LA-l單獨或聯合在MCD與正常飲食條件下TG倍數變化。(D)MCD飲食小鼠不同甘油脂（GL）相對變化（n=5）。(E)熱圖顯示LA-m、LA-l單獨或聯合在MCD與正常飲食條件下鞘脂（SP）與甘油磷脂（GP）倍數變化。(F–J)MCD飲食小鼠不同SP與GP（E）、神經酰胺（Cer）與鞘磷脂（SM）（F）、磷脂酰膽堿（PC）（G）、磷脂酰肌醇（PI）（H）、磷脂酰絲氨酸（PS）（I）、磷脂酰乙醇胺（PE）（J）相對變化（n=5）。(K)脂質脂肪酸側鏈統計。

5. 鞘脂積累誘導的內質網應激是LA-m與LA-l組合在體內外誘導肝毒性的主要驅動因素

脂質組學結果顯示，MCD誘導的MASH模型中，LA-m與LA-l聯用會造成肝臟鞘脂積累。為驗證其作用，采用鞘脂合成抑制劑ISP-1處理HepG2細胞，結果顯示ISP-1可顯著逆轉兩種脂肪酸聯用導致的細胞活力下降（圖5A），證實鞘脂蓄積參與該組合誘導的肝毒性。

已有研究表明內質網應激與脂毒性密切相關，因此該研究檢測了相關通路蛋白。結果顯示，LA-m與LA-l聯用可顯著上調p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK的表達（圖5B、5C）；使用IRE1α或JNK抑制劑均可恢復AML12和HepG2細胞的活力（圖5D、5E）。

機制上，ISP-1能夠下調p-IRE1α/IRE1α和p-JNK/JNK水平（圖5F），說明內質網應激激活發生在鞘脂積累的下游。動物實驗顯示，該聯用僅在MCD飲食小鼠肝臟中激活內質網應激（圖5G、5H），在正常飲食小鼠中無此效應（圖5I）。

結果表明，鞘脂積累介導的內質網應激激活是LA-m與LA-l聯用誘發肝毒性的核心機制。

圖5. MCD條件下月桂酸與亞油酸聯合誘導鞘脂蓄積，進而在體內外上調內質網應激相關蛋白水平。(A)HepG2細胞在存在或不存在ISP-1時，經LA-m、LA-l單獨或聯合處理24 h，檢測細胞活力。(B,C)AML12細胞（B）與HepG2細胞（C）經LA-m、LA-l單獨或聯合處理24 h后，采用蛋白質印跡法檢測p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK的相對表達與定量分析。(D,E)AML12細胞（D）與HepG2細胞（E）在存在或不存在4μ8c與SP600125時，經LA-m、LA-l單獨或聯合處理24h，檢測細胞活力。(F)HepG2細胞在存在或不存在ISP-1與LA-m、LA-l單獨或聯合處理24 h后，p-IRE1α/IRE1α與p-JNK/JNK水平。(G–I)采用蛋白質印跡法檢測MCD飲食（G,H）與正常飲食（I）小鼠肝臟組織裂解液中p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α、p-JNK/JNK蛋白水平。

6. 鐵死亡參與LA-m與LA-l聯合暴露加劇的MASH進展

鐵死亡是由脂質過氧化驅動的細胞死亡，AA/AdA-PE是誘發鐵死亡的關鍵磷脂。該研究脂質組學發現，MCD條件下LA-m與LA-l聯用可顯著升高AA/AdA-PE含量，提示鐵死亡可能參與其肝毒性過程。

進一步分子機制驗證顯示，LA-m與LA-l聯用可顯著上調AML12和HepG2細胞中鐵死亡關鍵蛋白ACSL4、TFR1的表達（圖6A、6B）；在MCD飲食小鼠肝臟中也出現一致變化（圖6C、6D），但正常飲食小鼠無此效應（圖6E）。使用鐵死亡抑制劑Lip-1可部分恢復細胞活力（圖6F），并降低脂質過氧化物LPO水平（圖6G、6H）。

亞油酸作為花生四烯酸（AA）的前體，LA-m可能通過促進亞油酸的酯化作用使肝細胞對鐵死亡更敏感。這也與已有研究結論一致。

綜上，MCD條件下，鐵死亡在LA-m與LA-l聯用誘導的肝毒性中發揮重要作用。

圖6. MCD條件下月桂酸與亞油酸聯合暴露可在體內外上調ACSL4與TFR1表達，進而加重MASH進展。(A–E)經LA-m、LA-l單獨或聯合處理后，檢測AML12細胞（A）、HepG2細胞（B）、MCD飲食小鼠（C,D）與正常飲食小鼠（E）中ACSL4與TFR1的相對表達及定量分析。(F)AML12細胞經1 μM Lip-1預處理6 h，再經LA-m、LA-l單獨或聯合刺激24h，評估細胞活力。(G,H)采用Liperfluo試劑盒定量檢測LA-m與LA-l聯合在MCD培養基中誘導AML12細胞（G）與HepG2細胞（H）的脂質過氧化物（LPO）水平上調。

04 研究結論

LA-m與LA-l組合在MCD飲食誘導的MASH小鼠模型中加重肝毒性，機制為鞘脂積累介導的內質網應激和甘油磷脂積累驅動的鐵死亡（圖7）。該研究結果為制定MASH患者飲食指南提供新依據。

圖7. 月桂酸與亞油酸聯合攝入加重MASH小鼠肝毒性但對健康小鼠無影響的機制示意圖。在MASH狀態下，LA-m與LA-l聯合誘導鞘脂（SP）蓄積，激活內質網應激并最終觸發鐵死亡；同時，該組合使甘油磷脂（GP）水平升高，進一步驅動鐵死亡。

05 未來展望

該研究初次清晰揭示了月桂酸與亞油酸聯合攝入會特異性加重代謝相關脂肪性肝炎（MASH）肝毒性，并系統闡明鞘脂蓄積—內質網應激—鐵死亡的核心損傷通路，為MASH人群膳食脂肪酸安全評估與臨床干預提供了頗具轉化價值的新方向。未來可進一步圍繞LA-m/LA-l誘導脂質紊亂的上游調控機制深入挖掘，重點解析絲氨酸棕櫚酰轉移酶（SPT）及鞘脂、鐵死亡相關關鍵酶的調控作用。同時依托該研究中發揮重要驗證作用的人源肝臟類器官(大橡科技）平臺，構建“膳食脂肪酸組合篩查—類器官毒性驗證—代謝人群風險分層"的標準化全鏈條研究體系，在高度仿生的3D模型上快速評估不同脂肪酸比例、不同中鏈脂肪酸組合對肝細胞的影響，大幅提升脂毒性預測的準確性與臨床相關性。此外，針對性開發靶向鞘脂代謝、內質網應激與鐵死亡通路的干預策略，最終將基礎研究成果轉化為可用于MASH患者膳食風險預警、毒性評估與精準營養管理的臨床應用方案，真正為代謝性肝病高危人群提供更安全、更科學的膳食指導。