治療性肽近年來受到廣泛關注，并越來越多地被開發用于治療各種疾病。它們的氨基酸序列及修飾經過專門設計，分子量通常在500 至 5,000 Da 之間。目前，全球有超過 100 種肽類藥物被批準用于治療各種疾病。有一種合成肽藥物是司美格魯肽，一種由32 個氨基酸組成的胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1, GLP-1）受體激動劑，用于治療 2 型糖尿病和長期體重管理。

在本應用方案中，為全面覆蓋生產、運輸和儲存過程中可能產生的潛在雜質，研究人員對司美格魯肽樣品進行了加熱和氧化強制降解，以促進潛在雜質的生成。強制降解結束后，使用 Thermo Scientific™ Vanquish™ Flex UHPLC 系統與 Thermo Scientific™ Orbitrap™ Exploris™ 240 質譜儀聯用進行司美格魯肽降解產物及潛在雜質分析 （圖1）。

圖1. 司美格魯肽降解產物鑒定實驗研究流程

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方案亮點

亮點一：

使用Thermo Scientific™ Hypersil GOLD™ Peptide 分析色譜柱，僅使用甲酸（formic acid, FA）作為流動相添加劑，也可實現對司美格魯肽及其降解產物的有效分離。

在常規的反相液相色譜多肽分析方法中，為了改善色譜峰形及提高分離度，通常使用三氟乙酸（trifluoroacetic acid, TFA）作為流動相添加劑，然而TFA會對質譜造成較強的離子抑制效應，故在液質聯用實驗中，甲酸是常用的流動相添加劑，但其抑制非特異性相互作用的效果較差，與肽段形成的疏水性離子對也較弱。在本研究中，我們開發了基于Hypersil GOLD Peptide 分析色譜柱的司美格魯肽液質聯用分析方法，僅使用甲酸作為流動相添加劑的同時，也能實現司美格魯肽及其雜質較好的分離效果（圖2）。

圖2. 司美格魯肽對照樣品、加熱強制降解樣品和氧化強制降解樣品在280nm波長下的UV色譜圖。TDP：司美格魯肽加熱強制降解產物，ODP：司美格魯肽氧化強制降解產物。（點擊查看大圖）

亮點二：

Orbitrap Exploris 240 二合一超高分辨質譜儀具有超高靈敏度，可實現低至0.005%水平的司美格魯肽降解產物的可靠且靈敏的鑒定。

使用Vanquish Flex-Orbitrap Exploris 240液質聯用平臺分別對司美格魯肽對照樣品、加熱強制降解樣品和氧化強制降解樣品進行數據依賴性質譜二級掃描（ddMS2），可對司美格魯肽全長產品（full length product, FLP）、雜質（存在于對照樣品中）和降解產物（由強制降解誘導產生）進行可信的檢測與鑒定。表 1 列出了相對豐度超過司美格魯肽 FLP 0.005%的所有降解產物（由強制降解樣品產生）和雜質（存在于對照樣品中），均由高質量二級譜圖檢測及鑒定得到。圖3展示了雜質（T5缺失）肽段的二級譜圖和二級碎片覆蓋率，放大區域可見證明氨基酸缺失區域的b/y離子。該雜質在對照樣品中的相對豐度僅為0.43%，證明了Orbitrap超高分辨質譜優異的靈敏度，為低豐度肽段的鑒定提供可信結果。

表1. 基于 UHPLC-HRAM MS 的司美格魯肽及其降解產物的鑒定和相對定量結果。該表使用由 Ardia 平臺支持的 Biopharma Finder 軟件的報告功能生成，包括所有相對豐度高于 0.005% 的強制降解產物和存在于對照樣品中的雜質。所有列出的結果在 Biopharma Finder 軟件中均滿足一級質量偏差小于 6 ppm 和 100 的置信度得分。

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圖3. 雜質（T5缺失）肽段的二級譜圖和二級碎片覆蓋率圖。（點擊查看大圖）

亮點三：

高質量的 HRAM 數據依賴性質譜二級掃描（ddMS2）數據能夠對共洗脫雜質（包括痕量水平的同量異位素雜質）進行準確可靠的鑒定。

Orbitrap HRAM MS 平臺的高分辨率、高靈敏度和高質量精度能夠助力用戶可靠地鑒定與司美格魯肽 FLP主峰共洗脫的痕量同質組分。如圖4所示，在對照樣品（ 數據未顯示）和加熱強制降解樣品中，通過高質量的一級及二級數據，鑒定到34.16 分鐘與司美格魯肽FLP主峰共洗脫的司美格魯肽 A2 缺失雜質，相對豐度僅為 0.022%，該 A2 缺失肽段的理論單同位素質量為 4026.0632 Da。同樣，在氧化強制降解樣品中，通過高質量的一級和二級數據， 鑒定到了司美格魯肽T5 缺失并在W24 位點發生單氧化的雜質降解產物，由于羥基在色氨酸側鏈芳香環上的不同位置，導致色氨酸氧化會在反相色譜上產生多個不同保留時間的色譜峰，故該 T5 缺失 + W24 氧化肽段在31.94~40.07 分鐘有多個色譜峰被洗脫，包括一個在34.17分鐘處與主峰共洗脫的峰。該雜質理論單同位素質量為 4026.0626 Da，與前述A2 缺失雜質的理論單同位素質量僅差0.0006 Da （0.14ppm）。由于A2缺失雜質來源于司美格魯肽樣品本身，故在氧化強制降解樣品中，該雜質會同司美格魯肽FLP主峰和氧化誘導的司美格魯肽T5 缺失并在W24 位點發生單氧化的雜質降解產物共洗脫，如圖4第二行所示，其 MS2 譜圖包含了與 A2 缺失（ 圖4第一行用藍色標注的 b/y 離子）和 T5 缺失+W24 氧化（圖4第三行用紫色標注的 b/y 離子）肽段均匹配的特征離子，證實了在氧化降解樣品中同時存在這兩種同量異位素肽雜質并與司美格魯肽主峰共洗脫。這兩種共洗脫的同量異位素肽雜質在氧化強制降解樣品中的總相對豐度為 0.022%。每種同量異位素肽的部分豐度通過前 3 個特征MS2 離子計算。通過這種方法，確定 A2 缺失雜質的相對豐度為 0.015%，而 T5 缺失 + W24 氧化的相對豐度為 0.007%。這個例子生動的展示了高質量的 HRAM MS數據對痕量同質異位素肽段，在色譜共洗脫的情況下，能夠助力實現不同雜質的精確定性及相對定量。

圖4. 氧化強制降解樣品中 34.17 分鐘低豐度共洗脫同量異位素肽雜質的鑒定。（A）來自加熱強制降解樣品（上圖）和氧化強制降解樣品（下圖）的m/z 1008.0245（4+）的 XIC（±10 ppm 離子提取窗口）。（B）加熱強制降解樣品中 34.16 分鐘洗脫的肽段（上圖）、氧化強制降解樣品中34.17 分鐘洗脫的肽段（中圖）和 31.94 分鐘洗脫的肽段（下圖）的高質量 MS2 譜圖。（C）MS2 譜圖局部放大（m/z 200–550）。（D）MS2 譜圖局部放大（m/z1230–1400）。來自 A2 缺失雜質的特征 b/y 離子用藍色標注。來自 T5 缺失 + W24 氧化降解產物的特征 b/y 離子用紫色標注。（點擊查看大圖）

結語：

使用 Vanquish Flex UHPLC 系統、Hypersil GOLD Peptide 分析色譜柱、Orbitrap Exploris 240 質譜儀并結合 BioPharma Finder 軟件，可對加熱強制降解和氧化強制降解的司美格魯肽樣品中的降解產物進行可靠鑒定，特別是對低豐度和共洗脫的同量異位素雜質，能夠助力客戶的日常研究。

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