前言

抗體-藥物偶聯物（antibody-drug conjugates, ADC）作為一類治療癌癥和自身免疫性疾病的生物醫藥類產品，近年來受到廣泛關注。ADC通常由單克隆抗體（monoclonal antibody, mAb）通過可降解/不可降解的連接子（linker）與小分子藥物（drug）共價偶聯，這樣的設計確保ADC可通過單抗精確識別靶細胞后，進入靶細胞并在胞內裂解釋放小分子藥物，從而實現精確殺傷靶細胞的目的。與單抗產品相同，電荷異質性也是ADC的關鍵質量屬性之一，會對其質量、安全性、穩定性和效價等造成影響，故監管機構也對ADC的電荷異質性表征提出了要求，作為ADC質量控制的一部分。由于ADC結構的高度異質性，除單抗本身的修飾等帶來的電荷異質性以外，連接子、小分子藥物等均有可能引入新的電荷異質性，這使得ADC的電荷異質性分析頗具挑戰性。

在本文的研究中，我們開發了基于在線多中心切割的2D UHPLC – native intact MS ADC電荷異構體分析方案，對市售的半胱氨酸偶聯ADC Polivy® 的電荷異質體進行了分析。第一維的分離采用強陽離子交換色譜 （strong cation exchange， SCX），第二維使用體積排阻色譜（size exclusion chromatography, SEC ）并使用與質譜可以兼容的醋酸銨緩沖體系，確保半胱氨酸偶聯ADC的鏈間非共價結合不會被破壞，能夠保持完整狀態進行質譜分子量分析，并測定其藥物-抗體比率 (Drug-antibody ratio, DAR)等關鍵質量屬性。Thermo Scientific™ Vanquish™ Online 2D-LC 系統與 Orbitrap™ Exploris™ 240 BioPharma超高分辨二合一質譜儀被用于分析，整體工作流程見圖1。

圖1. SCX-SEC-native intact MS 用于半胱氨酸偶聯ADC 工作流程示意圖。（點擊查看大圖）

方案亮點

亮點一：

Thermo Scientific™ ProPac™ 3R SCX 色譜柱與CX-1™ pH 梯度緩沖液配合使用，可在第一維色譜上對ADC電荷異構體進行有效分離。

本研究中第一維分離使用ProPac 3R SCX 色譜柱，該色譜柱采用3µm單分散填料，能夠對ADC的電荷異構體實現更好分離。CX-1™ pH 梯度緩沖液可以建立線性pH梯度，使用方便，重現性好，二者配合使用可在第一維強陽離子交換色譜上對Polivy的電荷異構體實現良好分離 （圖2）。

圖2. ¹D SCX (上) 與 ²D SEC （下） UV 譜圖，SEC譜圖為三個不同餾分（105 μL ¹D洗脫液），證明了反沖（黑色）與正沖（粉色）相比，可顯著改善²D SEC的峰型并提高其靈敏度。（點擊查看大圖）

亮點二：

 第二維反沖（backflush）及多中心切割可改善二維SEC峰型，提高其靈敏度，醋酸銨體系的使用可以實現與質譜的在線直連。

由于一維的SCX緩沖液體系中含有大量與質譜不兼容的緩沖鹽，故二維的SEC就顯得必不可少，可以在除去一維體系中緩沖鹽的同時，使半胱氨酸偶聯ADC保持近天然狀態，被送入質譜進行在線完整分子量測定。二維色譜的流路連接如圖3，第一維分離后的餾分按設置好的時間窗口被依次收集至樣品環中，其流路設計確保每個餾分以反沖的方式從樣品環中被送入二維色譜柱，可以改善二維SEC的峰型并提高其靈敏度（圖2/3）。

圖3. 多中心切割2D-LC-HRAM MS 系統流路圖，(A) 反沖， (B) 正沖。收集一維餾分的樣品環體積為250 μL。（點擊查看大圖）

亮點三：

Orbitrap Exploris 240 BioPharma 超高分辨二合一質譜儀可在非變性條件下對半胱氨酸偶聯ADC進行完整分子量測定，其高靈敏度有助于低豐度組分的準確鑒定。

在本文的研究中，第一維SCX分離總共鑒定到18個色譜峰（圖4），將18個峰按保留時間分為4組，每針進樣依次收集一組峰并送至質譜進行在線完整分子量分析，每個峰僅收集一次。得益于Orbitrap質譜的超高靈敏度，即使是相對豐度僅有0.43%的18號峰也可通過單次收集進行高分辨質譜的在線分析。

圖4. ¹D SCX UV譜圖，總共分離并鑒定到了18個色譜峰。下方的表格展示了每個峰的相對豐度及轉移至2D SEC的每個餾分的體積。（點擊查看大圖）

圖5展示了8號及9號兩個相對豐度最高的峰非變性質譜完整分子量測定的結果。從圖中可以發現，8號峰主要以偶聯兩個藥物的相關組分為主，9號峰主要以偶聯四個藥物的相關組分為主，說明偶聯藥物數目會對ADC的電荷異質性造成影響。

圖5. 圖4中8號峰及9號峰的一級質譜圖及解卷積結果。左，m/z=5000~7000Da，一級質譜圖。中，左圖紅色陰影區域放大，可見不同組分的質譜峰分布。右，解卷積結果。（點擊查看大圖）

對質譜結果進一步分析發現，單抗本身的修飾，如重鏈末端賴氨酸丟失、脫酰胺和氧化等也會對ADC電荷異質性造成影響。以11號峰和12號峰為例，11號峰中主要組分為D2+1Lys與D4+0Lys，12號峰中主要組分為D4+1Lys與D6+0Lys （圖6），在其他峰中也可觀察到類似的Dn+1Lys與Dn+1+0Lys分布模式，進一步證明了ADC電荷異構體的高度復雜性和使用超高分辨質譜對ADC電荷異構體進行分析的必要性。

圖6. 圖4中11號峰及12號峰的一級質譜圖及解卷積結果。左，m/z=5000~7000Da，一級質譜圖。中，左圖紅色陰影區域放大，可見不同組分的質譜峰分布。右，解卷積結果，可見賴氨酸變體導致的Dn+1Lys與Dn+1+0Lys分布模式。（點擊查看大圖）

如前文所述，即使是相對豐度只有0.43%的18號峰，得益于質譜平臺的高靈敏度，單針進樣并分離的18號峰仍然能夠得到高信噪比的質譜數據，從而實現蛋白分子量的準確鑒定。如圖7所示，該峰中主要包括D4、D6及D6和D8的賴氨酸變體，再次證明了前端分離技術和質譜平臺的靈敏度、分辨率及質量精度對痕量ADC電荷異構體鑒定的必要性。

圖7. 18號峰的 ¹D UV譜圖（上）及 ²D質譜圖和解卷積譜圖（下）。（點擊查看大圖）

圖8總結了¹D SCX分離后各個色譜峰中由質譜所鑒定到的主要組分，可見藥物偶聯數目及抗體本身的翻譯后修飾均會對ADC的電荷異質性產生影響。

圖8. ¹D SCX分離的各個色譜峰中主要成分匯總（左表）。脫酰胺和氧化多于酸性峰中被鑒定到，賴氨酸變體多見于堿性峰中。隨偶聯藥物數目的增加，ADC在SCX柱上的保留時間也相應增加。（點擊查看大圖）

結語：

本文開發了一種基于在線多中心切割的SCX-SEC-native intact MS 半胱氨酸偶聯ADC電荷異構體分析方案，將其應用于半胱氨酸偶聯ADC Polivy的電荷異質體分析中，并能得到良好結果。ProPac 3R SCX 色譜柱與CX-1 pH 梯度緩沖液配合使用，可實現ADC電荷異構體在第一維色譜上的有效分離，反沖能夠改善第二維SEC的色譜峰型并提高靈敏度，Orbitrap Exploris 240 BioPharma二合一超高分辨質譜儀能夠對ADC的各個異構體組分進行鑒定，包括痕量組分。該平臺普適性強，可對不同mAb/BsAb/ADC等生物分子進行電荷異質性分析。

掃描查看更多詳情

如需合作轉載本文，請文末留言。