藥物臨床實驗失敗的主要原因包括靶點驗證不足、療效缺乏以及脫靶導致的毒副作用等。因此，現代藥物開發不僅要求生物活性分子能夠調節疾病表型，還應明確其分子靶標。化合物、靶點和表型可視為臨床前藥物發現過程的三要素[1]。對于活性分子的未知作用靶點或潛在脫靶效應發現，通常需要通過高通量篩選的方法開展。由于90%以上的藥物靶點為蛋白質，因此基于質譜的蛋白質組學可在藥物靶點早期發現方面發揮重要作用。

圖1. 基于質譜的蛋白質組學在臨床前藥物發現過程中的應用[1]（點擊查看大圖）

目前，利用蛋白質組學進行靶點發現的方法大致可以分為兩種：基于衍生化修飾的化學蛋白質組學技術和利用化合物結合對蛋白質結構和生物物理特性的影響進行分析的方法。

基于衍生化修飾的化學蛋白質組學方法需要首先對目標化合物設計和連接某種探針分子[2]，再根據探針特點設計實驗將與化合物結合的蛋白進行富集。該方法存在的問題是前期開發周期較長，探針可能影響化合物活性構象，有些化合物修飾難度較大。

圖2. 基于衍生化修飾的化學蛋白質組學技術[2]（點擊查看大圖）

利用化合物結合對蛋白質結構和生物物理特性的影響進行分析的方法無需對配體進行化學修飾，包括LiP-MS (蛋白有限水解質譜)、TPP (熱蛋白組分析)、SPROX (蛋白質氧化速率穩定性技術)、TRAP (靶向響應可及性)等。

其中，Lip-MS[3]的設計原理基于蛋白與配體結合后，暴露不同的廣譜蛋白酶酶切位點，產生不同的蛋白酶切片段。中科院大連化物所葉明亮團隊開發的PELSA[4]方法可同時高靈敏鑒定配體結合蛋白和結合位點，近期還入選了首屆“中國蛋白質組學十大進展”。

圖3. Lip-MS技術[3]（點擊查看大圖）

圖4. PELSA技術[4]（點擊查看大圖）

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TPP[5]的設計原理是利用蛋白隨溫度升高發生降解，當結合藥物后，相同溫度下未降解蛋白的量會提高，該復合蛋白的熱熔曲線會右移。該方法還可用于活細胞水平的藥物靶點篩選。Gaetani[6]等在TPP的基礎上，開發了PISA方法，將不同溫度處理的樣品混合后定量檢測，極大降低了樣本檢測數。每種藥物靶點篩選方法都有各自的優勢和不足，需根據應用場景選擇適合的一種或多種方法結合分析。

圖5. TPP技術[5]（點擊查看大圖）

圖6. PISA技術[6]（點擊查看大圖）

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由于很多靶標蛋白在體內含量較低，且蛋白與配體結合后可檢測的變化差異往往也較小，這就需要后續的質譜檢測方法提供盡可能高的蛋白檢測靈敏度和定量準確性。以PISA為例，該方法雖然極大簡化了TPP實驗流程和樣本量，但由于將不同溫度點樣本合并，ΔSm反映出的定量差異往往更小。因此，以往檢測常采用TMT標記后分多個餾分，再對每個餾分進行長梯度LC-MS分析。TMT標記對于不熟悉蛋白組學樣品前處理的研究者來說還是具有比較大的挑戰。近年來，隨著質譜技術和AI算法的進步，DIA采集和分析策略方面都取得了進展。尤其是Orbitrap Astral質譜儀，可實現2-Th窄窗口式數據非依賴性采集(nDIA)，在蛋白質組鑒定深度、數據完整性、定量精度和通量方面都表現優異。

我們以具有明確靶點的藥物甲氨蝶呤(MTX)為例進行了Astral PISA-DIA測試，分別將DMSO或2mM MTX與人胰腺癌細胞系PANC-1裂解液孵育，并在45-60℃范圍內進行6個不同溫度加熱處理，合并加熱后樣本，轉移上清進行常規label free蛋白組學前處理，之后通過23分鐘梯度的Astral nDIA方法進行檢測；各組設置3個重復。本次測試使用DIA-NN軟件分析，共定量7380個蛋白組；以差異倍數(FC) 1.5、p＜0.05閾值，共篩選出248個上調和368個下調蛋白；MTX的已知靶點DHFR顯著性變化在本次測試中也明確鑒定到。

與傳統PISA-TMT相比，Astral PISA-DIA顯著簡化了樣本制備流程，并在極大縮短檢測時間的前提下可得到理想的鑒定結果。這也將使實際研究中進行不同藥物濃度和加熱溫度等實驗條件對比優化更加便捷。

圖7. Orbitrap Astral PISA-DIA測試結果 （點擊查看大圖）

在蛋白質組學發現方面，Orbitrap Astral展示出強大的檢測通量和覆蓋深度，已使開展大規模的臨床樣本檢測、發現新的潛在生物學標志物成為可能，助力疾病診斷更精準。在藥物早期發現階段，結合多種靶點發現方法和Astral的優異性能，也將更好的助力新化合物靶點發現、藥物新作用靶點篩選、脫靶風險評估等研究，進而加速整體藥物研發進程和降低后期臨床失敗風險。

圖8. Orbitrap Astral助力藥物靶點發現研究（點擊查看大圖）

參考文獻：

1. Meissner F, Geddes-McAlister J, Mann M, et al. The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2022, 21(9): 637-654.

2. Chen X, Wang Y, Ma N, et al. Target identification of natural medicine with chemical proteomics approach: probe synthesis, target fishing and protein identification[J]. Signal Transduction and Targeted Therapy, 2020, 5(1): 72.

3. Malinovska L, Cappelletti V, Kohler D, et al. Proteome-wide structural changes measured with limited proteolysis-mass spectrometry: an advanced protocol for high-throughput applications[J]. Nature Protocols, 2023, 18(3): 659-682.

4. Li K, Chen S, Wang K, et al. A peptide-centric local stability assay enables proteome-scale identification of the protein targets and binding regions of diverse ligands[J]. Nature Methods, 2025, 22(2): 278-282.

5. Franken H, Mathieson T, Childs D, et al. Thermal proteome profiling for unbiased identification of direct and indirect drug targets using multiplexed quantitative mass spectrometry[J]. Nature protocols, 2015, 10(10): 1567-1593.

6. Gaetani M, Sabatier P, Saei A A, et al. Proteome integral solubility alteration: a high-throughput proteomics assay for target deconvolution[J]. Journal of proteome research, 2019, 18(11): 4027-4037.

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