一韋儀器加強型冷凍組織研磨儀HGC48用于土壤微生物宏基因組DNA提取的前處理方案

馮偉-上海一韋儀器科技有限公司

方案概述

土壤是地球上最復雜的微生物棲息地之一，富含細菌、真菌、放線菌等多種微生物。土壤微生物宏基因組學研究依賴于高質(zhì)量、高純度的總DNA提取，然而土壤樣本中腐殖酸、黃腐酸等有機質(zhì)會強烈抑制下游PCR擴增和測序反應(yīng)。傳統(tǒng)手動研磨難以徹底破碎土壤中孢子、菌絲等結(jié)構(gòu)，且處理通量低、重復性差。一韋儀器HGC48加強型冷凍組織研磨儀采用垂直三維振蕩研磨方式，配合液氮冷凍預處理，可在1分鐘內(nèi)同時高效破碎48個土壤樣本中的微生物細胞，同步實現(xiàn)土壤團聚體的精細粉碎，結(jié)合冷凍條件保護核酸免受降解。全封閉研磨體系有效避免樣品間交叉污染，確保宏基因組數(shù)據(jù)的真實性和可靠性，適用于土壤微生物多樣性分析、宏基因組測序及環(huán)境DNA研究等領(lǐng)域。

實驗儀器和材料

·       儀器：一韋儀器HGC48加強型冷凍組織研磨儀（配2ml研磨管48孔標準適配器）

·       材料：農(nóng)田表層土壤（0-20cm）、5mm氧化鋯研磨珠、液氮、土壤DNA提取試劑盒（含裂解緩沖液、蛋白酶K）、CTAB提取緩沖液、氯仿-異戊醇、無水乙醇、TE緩沖液（pH 8.0）

實驗步驟

1.       采集農(nóng)田表層土壤，去除植物根系和石礫，過2mm篩后充分混勻，分裝為每份0.5g置于無菌離心管中。

2.       取0.5g土壤樣本轉(zhuǎn)移至預冷的2ml研磨管中，每管加入3顆5mm氧化鋯研磨珠和800μl預冷CTAB裂解緩沖液（含2% β-巰基乙醇）。

3.       將研磨管浸入液氮速凍2分鐘，取出后迅速固定于一韋儀器HGC48適配器中，對稱安裝并確保配平平衡。

4.       設(shè)置一韋儀器HGC48研磨參數(shù)：頻率65Hz，時間90秒，冷凍模式溫度設(shè)為-20℃。

5.       啟動研磨程序，待運行結(jié)束后取出研磨管，置于65℃水浴中溫育30分鐘，期間每10分鐘顛倒混勻一次。

6.       加入等體積氯仿-異戊醇（24:1），劇烈振蕩混勻，12000rpm離心10分鐘，小心吸取上層水相。

7.       加入0.6倍體積異丙醇沉淀DNA，-20℃靜置30分鐘后離心，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀兩次，空氣干燥后溶于50μl TE緩沖液。

8.       取5μl DNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Nanodrop 2000測定濃度及A260/A280、A260/A230比值。

實驗數(shù)據(jù)

結(jié)論

一韋儀器加強型冷凍組織研磨儀HGC48配合液氮冷凍預處理，可在90秒內(nèi)高效破碎土壤團聚體和各類微生物細胞（包括芽孢和厚壁菌），獲得高質(zhì)量、高純度的宏基因組DNA。全封閉操作有效杜絕樣品間交叉污染，適配器高通量設(shè)計支持一次運行處理48個土壤樣本，為環(huán)境微生物組學研究提供了標準化、可重復的前處理解決方案。