對于未知ADC樣品，建議先使用Biozen™ Native RP-5建立整體DAR分布，觀察DAR ladder的主分離窗口；如果低DAR物種保留不足，再進一步評估Biozen™ Native RP-1。

當payload疏水性較弱，或特別關注DAR0保留并希望與buffer區域分開時，也可以優先評估Biozen™ Native RP-1。

圖1. Biozen™ Native RP-1與Biozen™ Native RP-5對比譜圖

不同Native RP柱化學會影響早洗脫DAR物種的保留。RP-5適合建立整體DAR ladder；RP-1可用于增強DAR0和低DAR物種的保留。

如果 DAR ladder 整體分離不足，首先建議拉緩主分離梯度，尤其是 15–50%B 或等效主分離區間。同時可進一步比較 Biozen™ Native RP-1 / RP-5、鹽濃度、pH 和有機相類型。

需要注意的是，Native RP 方法中不能只看儀器方法里的 %B。推薦體系中，B 相通常為 IPA / 50 mM Ammonium Acetate = 50/50，v/v。因此，50%B 對應的真實 IPA 含量為 25%。主分離窗口通常不建議超過真實 IPA 25%，100%B 更多用于短暫清洗疏水殘留。

通常不建議只依賴拉長梯度。DAR0 是低疏水性的 ADC 物種，與反相固定相的相互作用較弱，因此更容易靠近死時間洗脫。如果樣品中含有鹽、糖、表活或其他制劑輔料，也可能進一步影響早洗脫區域背景和 DAR0 保留。

DAR0保留不足時，更建議按照以下順序判斷：

• 是否需要從 Biozen™ Native RP-5 切換到 Biozen™ Native RP-1；

• 是否需要降低流動相鹽濃度；

• 初始真實 IPA 是否過高；

• 樣品 buffer 或制劑輔料是否影響早洗脫區域；

• 是否需要從兩相體系切換到三相體系。

在 Biozen™ Native RP 方法中，鹽濃度會影響 DAR 物種的保留和選擇性。對于 DAR0 或低 DAR 物種保留不足，可嘗試降低 ammonium acetate 濃度，例如從 20–25 mM 繼續向低鹽范圍篩選，必要時可評估 5–10 mM。

經驗上，低離子強度通常更有利于早洗脫 DAR 物種的保留和分離。因此，當 DAR0 在 Biozen™ Native RP-5 上接近不保留時，可以優先考慮 Biozen™ Native RP-1 + 低鹽條件。

圖2. 不同鹽濃度下低 DAR 區域對比譜圖

當 DAR0 與 buffer 或早洗脫基質區域重疊時，兩相體系的調節空間可能不夠。因為在兩相方法中，鹽濃度、有機相比例和梯度變化往往被綁定在一起，難以單獨調節方法初始階段的保留環境。

三相體系的優勢在于，可以把初始鹽濃度、水相比例和后續 IPA 梯度分開控制，從而更精細地調節 DAR0 的保留和峰形。

這一部分建議作為文章的核心展開，并配合譜圖和方法表呈現。正文不需要過度解釋機理，重點讓讀者一眼看到“兩相變三相"的核心變化。

圖3. 兩相方法 vs 三相方法對比譜圖

兩相體系中 DAR0 可能靠近 buffer 或早洗脫基質區域；切換至三相體系后，可通過初始低鹽水相增強 DAR0 保留，再進入含 IPA 的主分離梯度，從而改善 DAR0 與早洗脫區域的區分度。

圖4. 三相方法梯度表

Biozen™ Native RP 方法中，不能只看儀器方法里的 %B 或 %C，更要計算真實 IPA。例如 C 相為 IPA / 50 mM Ammonium Acetate = 50/50，v/v，因此 50%C 對應真實 IPA 25%。

如果真實 IPA 過高，可能影響 ADC intact/native 狀態，也可能導致早洗脫物種保留進一步降低。對于 DAR0 或裸抗峰形拖尾的情況，可以在初始條件中加入少量 IPA，但建議從真實 IPA 1–3% 起篩，而不是盲目提高有機相比例。

會，尤其是制劑樣品或 LC-MS 分析。鹽、糖、表活和其他輔料可能影響早洗脫區域背景，也可能影響 MS 響應。

如果進行 LC-MS 分析，建議進行 buffer exchange，例如置換至 20 mM Ammonium Acetate pH 5.2，或 20 mM Ammonium Formate pH 5.0，以減少制劑組分對 MS 源的污染，并改善靠近死時間洗脫的 DAR0 靈敏度。

對于 UV 方法，也建議完整記錄樣品 buffer、濃度、上柱量和稀釋方式。這樣在后續判斷保留變化時，才能區分是色譜條件變化，還是樣品基質變化引起的。

Biozen™ Native RP 方法優化并不是簡單地提高有機相或拉長梯度，而是圍繞柱化學、鹽濃度、真實 IPA、三相體系和樣品前處理建立系統判斷。

對于 ADC intact DAR 分析，可以先用 Biozen™ Native RP-5 建立整體 DAR ladder，再根據低 DAR 區域表現評估 Biozen™ Native RP-1。當 DAR0 靠近死時間或與 buffer 區域重疊時，從兩相體系切換到三相體系，往往能夠為早洗脫區域提供更精細的調控空間。