在生命科學研究中，從實體組織獲得高質量的單細胞懸液是許多實驗的起點。無論是單細胞測序、原代細胞培養，還是流式細胞術分析，組織解離的效率和細胞活性直接決定下游實驗的成敗。膠原酶作為解離膠原纖維網絡的關鍵工具，其選型與使用方案的科學性至關重要。

一、膠原酶家族：五位成員各有所長

膠原酶是目前能夠降解具有三股超螺旋結構的天然膠原纖維的蛋白酶，在組織解離中扮演著不可替代的角色。膠原酶源自溶組織梭菌，根據酶活性組成、底物特異性、適用組織差異，分為 I/II/III/IV/V 五種類型，每種都有自己的“看家本領"：

膠原酶 I型：含有比較均勻的多種酶活（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性），主要用于上皮、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的分離。

膠原酶 II型：梭菌蛋白酶活性更高，特別擅長處理肝臟、骨、甲狀腺、心臟和唾液腺、軟骨等致密組織。

膠原酶 III型：含較低的蛋白水解活性，但具典型的膠原酶活性，常用于乳腺組織的原代細胞制備。

膠原酶 Ⅳ型：含較低的胰酶活性以降低對膜蛋白和受體的損害，通常用于胰島細胞制備，和維持受體完整性比較重要的其他研究，也可用于髓系細胞制備。

膠原酶Ⅴ型：膠原酶和酪蛋白酶活性更高，更低胰酶水平以降低對膜蛋白和受體造成損傷，適用于胰島制備。

二、Hanks平衡鹽溶液（HBSS）：膠原酶的“最佳伴侶"

Hanks平衡鹽溶液（HBSS） 絕不僅僅是一瓶“鹽水"。它可用于細胞解離前的沖洗、運輸細胞或組織樣品、稀釋細胞用于計數，以及配制各種試劑溶液。

膠原酶的活性依賴于Ca2?和Mg2?離子，Hanks平衡鹽溶液(含Ca2+、Mg2+)正是提供這一環境的理想選擇。

膠原酶儲存液制備：

1、100mg膠原酶內加入100µl含鈣鎂的HBSS緩沖液，輕輕漩渦震蕩確保溶解混勻；

2、 根據具體批次的酶活力，用含鈣鎂的HBSS緩沖液調整酶濃度到100U/µl（1000×儲存液），之后用低蛋白吸附濾膜過濾除菌；

3、立即使用或將儲存液根據單次用量分裝，置于-20℃避光保存；

4、使用前置于冰上融化，避免反復凍融。建議膠原酶的工作濃度范圍50-200U/ml（或0.5-2.5mg/ml），具體使用濃度請根據具體消化對象或參考文獻來調整。

三、膠原酶解離黃金搭檔

膠原酶主攻膠原蛋白，但細胞外基質中還有很多其他成分，這時就需要“助攻手"。

胰蛋白酶（Trypsin）：選擇性水解精氨酸和賴氨酸肽鏈的肽鏈內切酶，切割位點為精氨酸殘基中的羧基端，可降解細胞間結合蛋白。若樣本為致密組織、纖維化組織、腫瘤、肝臟、肌肉等難消化樣本時，膠原酶可先降解膠原骨架，胰蛋白酶后續斷開細胞連接，從而實現快速分散。

胰蛋白酶常用工作濃度為0.25%；鈣、鎂離子會抑制胰蛋白酶，而EDTA可以螯合培養基中的二價離子（Ca2?、Mg2?），所以EDTA 常與胰蛋白酶一起添加，促進消化；另外，血清也會抑制胰蛋白酶的活性。

分散酶II（Dispase II）：來源于多粘芽孢桿菌中提取的中性金屬蛋白酶，能快速有效且溫和的破壞組織細胞外基質釋放單細胞培養物（原代細胞培養物），防止細胞抱團、減少絮狀沉淀、提高單細胞懸液純度。與膠原酶聯合使用，實現"膠原酶破壞基質+分散酶溫和分離"的協同效應。

DNase I（脫氧核糖核酸酶I）：組織解離過程中，不可避免會出現少量細胞破裂，破裂細胞會釋放大量游離DNA；游離DNA具備強黏性，會造成細胞拉絲抱團、溶液渾濁、篩網堵塞，直接降低單細胞得率，是單細胞測序、腫瘤組織解離最大隱形難題。

DNase I（脫氧核糖核酸酶I）專一降解游離雙鏈DNA，不損傷完整活細胞膜、不破壞細胞表面抗原；快速消解解離液粘稠度，減少細胞聚團，大幅提升單細胞懸液純度。

四、產品應用文獻案例分享

1、 GLP-1RAs attenuated obesity and reversed leptin resistance partly via activating the microbiome-derived inosine/A2A pathway. Acta Pharm Sin B. 2024 Dec 9. 影響因子：14.7.
使用愛必信的膠原酶Ⅰ(abs47048000)，解離小鼠的附睪白色脂肪組織（eWAT），獲取基質血管組分（SVFs），在37°C下消化30分鐘。

2、Notoginsenoside R1-loaded mesoporous silica nanoparticles targeting the site of injury through inflammatory cells improves heart repair after myocardial infarction. Redox Biology. 2022 Aug 1 . 影響因子：10.787.
使用濃度為0.1% 的愛必信膠原酶Ⅱ（abs47048001），在37℃下進行多次、短時間的消化分離新生大鼠和成年小鼠的原代心肌細胞。

3、GM-CSF mediates immune evasion via upregulation of PD-L1 expression in extranodal natural killer/T cell lymphoma. Molecular Cancer. 2021 May 29 . 影響因子：27.401.
使用愛必信膠原酶Ⅳ（abs47048003）解離小鼠腫瘤組織，在37°C下孵育2小時，處理后的細胞懸液用于流式細胞術分析。