一、ICG-COOH 的核心特點

1. 基本結(jié)構(gòu)與標識

• 化學(xué)名稱：羧基 - 吲哚菁綠，Indocyanine Green Carboxylic Acid

• 分子式：C??H??N?O?S，分子量：730.95

• 結(jié)構(gòu)特征：吲哚菁綠核心骨架 + 末端羧基 (-COOH) 活性基團，保留 ICG 光學(xué)特性同時提供化學(xué)修飾位點

2. 理化特性

3. 光學(xué)特性（核心優(yōu)勢）

• 激發(fā)波長：約 780–786 nm，發(fā)射波長：約 810–822 nm，位于近紅外 I 區(qū) (NIR-I)

• 摩爾消光系數(shù)：≈2.18×10? L·mol?1·cm?1，熒光量子產(chǎn)率：≈0.04

• 組織穿透深度：可達厘米級，顯著優(yōu)于可見光染料

• 低背景干擾：避開生物組織自發(fā)熒光區(qū)域，信噪比高

• 光熱轉(zhuǎn)換能力：可吸收近紅外激光能量并釋放熱量，適用于光熱治療

4. 化學(xué)活性與生物相容性

• 核心活性位點：羧基 (-COOH)，可通過縮合劑活化與氨基 (-NH?) 形成穩(wěn)定酰胺鍵

• 偶聯(lián)選擇性：優(yōu)先與伯胺反應(yīng)，可標記蛋白質(zhì)、抗體、多肽、納米顆粒等

• 生物安全性：繼承 ICG 的臨床應(yīng)用安全性，經(jīng) FDA 批準用于人體血管造影等診斷

• 多功能性：可同時實現(xiàn)熒光成像與光熱治療，構(gòu)建診療一體化探針

二、ICG-COOH 的標記方案（EDC/NHS 活化法）

1. 標記原理

2. 標準標記流程（以蛋白質(zhì) / 抗體為例）

（1）前期準備

（2）羧基活化（關(guān)鍵步驟）

1. 取適量 ICG-COOH 儲備液加入 MES 緩沖液中，終濃度 0.1–1 mg/mL

2. 加入EDC（10–20 倍摩爾過量于 ICG-COOH）和NHS（5–10 倍摩爾過量于 ICG-COOH）

3. 室溫避光反應(yīng) 15–30 分鐘，活化羧基生成 NHS 酯

（3）偶聯(lián)反應(yīng)

1. 將活化的 ICG-COOH 溶液加入蛋白溶液中，染料：蛋白摩爾比 = 5:1 至 20:1（推薦 10:1 起始）

2. 調(diào)整反應(yīng)體系 pH 至 7.0–7.5，室溫避光孵育 1–2 小時（或 4℃過夜）

3. 加入 10 mM 羥胺或 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)，孵育 10 分鐘終止反應(yīng)，淬滅未反應(yīng)的 NHS 酯

（4）純化（非可選步驟）

（5）產(chǎn)物表征與保存

1. 標記效率 (DOL)：通過紫外 - 可見 - 近紅外分光光度計計算，DOL=1–5 為宜，過高易導(dǎo)致蛋白聚集與熒光淬滅

2. 熒光性能：熒光分光光度計檢測激發(fā) / 發(fā)射光譜，確保光學(xué)參數(shù)正常

3. 活性檢測：ELISA 或細胞結(jié)合實驗驗證蛋白 / 抗體活性保留率

4. 保存：4℃避光短期保存（1–2 周），-20℃或 - 80℃長期保存，添加 0.01% 疊氮鈉防污染

3. 不同生物分子的標記要點

4. 關(guān)鍵注意事項

1. 全程避光：ICG 對光敏感，所有操作在避光條件下進行，使用棕色容器

2. pH 控制：活化階段 pH 5.5–6.5，偶聯(lián)階段 pH 7.0–7.5，確保反應(yīng)效率與熒光穩(wěn)定性

3. 摩爾比優(yōu)化：根據(jù)目標分子調(diào)整染料比例，平衡標記效率與生物活性

4. 雜質(zhì)去除：未反應(yīng)染料會導(dǎo)致高背景，必須純化

5. 現(xiàn)配現(xiàn)用：ICG-COOH 儲備液建議 24 小時內(nèi)用完，避免降解

三、應(yīng)用領(lǐng)域

1. 生物成像：活體腫瘤定位、血管造影、細胞追蹤、手術(shù)導(dǎo)航

2. 藥物遞送：構(gòu)建熒光示蹤型藥物載體，實時監(jiān)測藥物分布與釋放

3. 光熱治療：近紅外光照射下產(chǎn)生熱量，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，實現(xiàn)診療一體化

4. 生物傳感器：基于 FRET 原理開發(fā)近紅外熒光傳感器，檢測生物分子相互作用

5. 材料功能化：修飾聚合物、水凝膠、MOF 等材料，構(gòu)建熒光響應(yīng)體系