摘要：無細胞蛋白合成（cell free system）因其開放、可調控、篩選效率高等特點，正在成為復雜蛋白表達與純化優化的重要技術路徑。本文圍繞eProtein Discovery高通量蛋白表達篩選系統，結合添加劑組合優化與復雜轉錄因子TF L表達案例，系統解析無細胞系統如何通過可溶性標簽、金屬離子、分子伴侶、氧化還原調節劑等條件篩選，提高難表達蛋白的可溶性、純化得率和功能活性，為復雜蛋白制備、結構功能研究與藥物研發提供技術參考。

關鍵詞：無細胞蛋白合成、無細胞蛋白表達、cell free system、無細胞系統、高通量蛋白表達篩選、全自動蛋白表達篩選、無細胞蛋白表達篩選、eProtein Discovery、蛋白表達優化、復雜蛋白制備、轉錄因子表達、可溶性標簽、蛋白純化

一、為什么復雜蛋白需要進行表達條件優化？

在蛋白質結構與功能研究中，不同蛋白對表達環境的需求差異很大。對于結構簡單、穩定性較好的蛋白，傳統大腸桿菌、昆蟲細胞或哺乳動物表達體系通常可以滿足基礎制備需求。但對于結構復雜、折疊要求高、易聚集或依賴輔因子的蛋白，傳統體系常常面臨明顯限制。

常見難點包括：

• 蛋白錯誤折疊，形成包涵體；

• 可溶性差，表達后難以純化；

• 需要特定金屬離子或輔因子才能維持結構；

• 含多個半胱氨酸或二硫鍵，對氧化還原環境敏感；

• 含內在無序區域，容易降解或聚集；

• 全長蛋白表達困難，只能獲得截短片段；

• 純化后功能活性不足，無法用于下游實驗。

這些問題在轉錄因子、膜蛋白、金屬酶、含二硫鍵蛋白、毒性蛋白、GPCR及其他復雜調控蛋白中尤其常見。

無細胞蛋白合成體系的優勢在于，它不依賴完整細胞生長環境，而是在開放反應體系中完成蛋白合成。研究者可以根據目標蛋白特點，靈活調整反應條件，例如添加金屬離子、輔因子、分子伴侶、氧化還原調節劑或標簽切割酶，從而更快找到適合目標蛋白的表達環境。

這也是無細胞系統區別于傳統表達體系的重要價值：它不是只提供一個固定表達環境，而是提供一個可以被快速篩選和調控的系統。

二、無細胞蛋白合成系統的篩選邏輯

eProtein Discovery系統將無細胞蛋白合成與數字微流控技術結合，可用于高通量蛋白表達篩選。系統支持多種DNA構建體與多種無細胞混合體系進行組合篩選，從而快速評估不同表達條件對蛋白可溶性、表達量、純化能力及功能活性的影響。

其核心篩選邏輯包括：

1. 設計多個目標蛋白構建體；

2. 對構建體進行密碼子優化；

3. 引入不同可溶性標簽；

4. 搭配不同無細胞混合體系；

5. 同步評估表達量、可溶性和純化表現；

6. 選擇表現更優的組合進行放大制備；

7. 對純化蛋白進行SDS-PAGE、Western blot或功能實驗驗證。

系統可在較短時間內生成大量表達條件數據，用于判斷目標蛋白適合哪類構建體、哪種標簽、哪類添加劑組合以及哪種無細胞反應體系。

圖1：eProtein Discovery系統流程圖：48小時內完成從DNA到可直接用于實驗的蛋白制備。

三、添加劑體系：無細胞系統優化復雜蛋白的關鍵

無細胞蛋白合成系統的重要優勢之一，是可以根據目標蛋白結構特點加入不同添加劑。不同添加劑在蛋白折疊、活性維持、穩定性提升和可溶性改善方面發揮不同作用。

常見添加劑類型包括：

1. 金屬離子

許多蛋白依賴金屬離子維持結構或催化活性。相關研究中，約25%–50%的蛋白質屬于金屬結合蛋白。對于這類蛋白，金屬離子不僅影響蛋白穩定性，也可能直接決定其是否具備酶活性。

常見金屬離子包括：

• Zn2?

• Mn2?

• Ca2?

例如，Zn2?可用于穩定富含半胱氨酸的鋅結合區域；Mn2?可作為部分酶類蛋白的關鍵輔因子；Ca2?則可能對某些蛋白的熱穩定性產生積極影響。

2. 有機輔因子

部分酶類蛋白需要有機輔因子才能形成正確構象或發揮催化功能。若體系中缺少對應輔因子，即使蛋白成功表達，也可能無法獲得理想活性。

常見有機輔因子包括：

• NAD

• PLP

• FAD

• Acetyl-CoA

• SAM

例如，PLP可參與轉氨酶類蛋白的催化過程；NAD常與氧化還原酶類蛋白相關；SAM則與甲基轉移過程有關。

3. 分子伴侶

分子伴侶可幫助新生肽鏈折疊，減少錯誤折疊和聚集。對于易聚集蛋白、結構復雜蛋白和多結構域蛋白，加入分子伴侶常常能改善可溶性表達結果。

常見分子伴侶包括：

• DnaK伴侶混合物

• TrxB1

4. 氧化還原調節劑

含半胱氨酸較多、存在二硫鍵或對氧化還原狀態敏感的蛋白，往往需要合適的氧化還原環境。氧化還原調節劑可幫助維持半胱氨酸殘基狀態，降低錯配、聚集或結構異常風險。

常見組合包括：

• GSSG

• PDI/GSSG

即使目標蛋白本身不形成典型二硫鍵，合適的氧化還原條件也可能幫助維持半胱氨酸相關結構區域的穩定性。

5. 標簽切割酶

可溶性標簽常用于提升蛋白表達和純化效果，但在部分功能實驗或結構研究中，需要去除標簽。此時可加入3C蛋白酶等工具酶，用于標簽切除。

四、添加劑組合篩選策略

在實際使用無細胞蛋白表達篩選系統時，添加劑并不是越多越好，而是需要根據目標蛋白特征進行合理組合。

常見判斷邏輯如下：

1. 含金屬結合位點的蛋白：優先測試Zn2?、Mn2?、Ca2?等金屬離子；

2. 輔酶依賴型酶類：優先測試NAD、PLP、FAD等有機輔因子；

3. 易聚集或折疊困難蛋白：優先搭配DnaK、TrxB1等分子伴侶；

4. 含多半胱氨酸或二硫鍵相關蛋白：優先評估PDI/GSSG、GSSG等氧化還原體系；

5. 需要去除可溶性標簽的蛋白：可加入3C蛋白酶用于后續標簽切除；

6. 未知結構或復雜結構域蛋白：可通過多種構建體與多種無細胞混合體系組合篩選。

圖2：添加劑指導決策樹。每種表達用無細胞混合物中至多可添加兩種添加劑。

五、案例背景：復雜轉錄因子TF L的表達挑戰

轉錄因子是調控多種細胞通路的關鍵蛋白，常被稱為“主控調節因子"。其中，轉錄因子L（TF L）在神經分化、造血及器官發生等發育過程中發揮重要作用，對維持干細胞多能性，以及中樞神經系統、眼部等組織正常發育十分關鍵。

但TF L的表達與純化具有明顯挑戰，尤其是全長形式或特定功能結構域，常規體系中并不容易獲得高質量蛋白。

其主要困難包括：

• 含LIM結構域；

• 含同源結構域；

• 存在內在無序區域；

• 在大腸桿菌中容易錯誤折疊形成包涵體；

• 復性條件難以優化；

• 功能蛋白得率較低；

• 在昆蟲細胞、哺乳動物細胞和酵母體系中也可能出現得率不足、純化復雜或蛋白降解問題。

這些問題會限制TF L的結構研究、功能驗證和靶向藥物開發。

在該案例中，研究采用eProtein Discovery系統表達并純化了三類TF L變體：

• 全長TF L；

• 未知功能結構域L2；

• DNA結合結構域L3。

并通過可溶性標簽、Zn2?、GSSG、PDI/GSSG等無細胞混合體系優化表達條件，最終獲得可用于功能驗證的蛋白樣品。

六、構建體設計與結構預測

本研究將三種TF L變體導入eProtein Discovery云軟件進行密碼子優化，并在兩端添加3C和TEV序列。L2和L3變體的設計借助系統內置AlphaFold結構預測工具完成，通過識別并分離TF L的重要功能區域，設計用于表達篩選的不同截短蛋白。

每個構建體的C端均包含：

• Strep-tag：用于磁珠純化；

• 檢測標簽：用于蛋白表達及純化后的定量分析。

最終構建了24個eGene構建體，包括多個含不同可溶性標簽的表達載體，以及1個無可溶性標簽對照載體。

圖3：TF L變體的AlphaFold結構預測。圖示為全長TF L的預測結構，重點關注區域已高亮標注。蛋白變體L2和L3基于上述區域篩選設計，同時獲得這些截短蛋白的結構預測結果。

圖4：eGene構建體與無細胞混合體系篩選。（A）含可溶性標簽的TF L eGene構建體設計方案。（B）用于提高可溶性蛋白得率的無細胞混合體系篩選結果。

七、無細胞混合體系設計

本研究選取8種無細胞混合體系。這些體系包含無細胞核心蛋白翻譯機制，并額外加入不同功能添加劑，包括：

• 金屬輔因子；

• 分子伴侶DnaK；

• 二硫鍵促進劑PDI+/GSSG；

• 用于可溶性標簽切除的3C蛋白酶。

由于TF L含有兩個LIM結構域，因此特別選用Zn2?作為關鍵添加劑，用于穩定TF L中富含半胱氨酸的鋅結合區域。

實驗中，將24個eGene構建體與8種無細胞混合體系，連同純化磁珠、對照樣品、空白樣品和洗脫緩沖液一同加載至卡盒中。借助系統自動化功能，該實驗設置可生成并分析192組表達圖譜。

系統會自動篩選每種TF L變體對應的10組高表達eGene/無細胞混合體系組合，用于后續純化，并通過蛋白檢測確定預測放大生產得率。上述流程均可在24小時內完成。

這種篩選方式的價值在于，它可以在短時間內同時評估多個關鍵變量，包括：

• 構建體長度；

• 可溶性標簽類型；

• 無細胞混合體系；

• 添加劑組合；

• 純化可行性；

• 預測放大得率。

八、放大生產與蛋白純化

針對每種TF L變體，研究選取預測純化得率最高的無細胞表達組合進行過夜放大培養，并采用放大生產專用試劑純化，最終獲得微克級目標蛋白。

后續通過SDS-PAGE和Western blot實驗驗證蛋白表達與純化情況。

在放大生產中，關鍵觀察點包括：

• 蛋白條帶是否與預期分子量一致；

• 洗脫組分中是否出現目標蛋白；

• 純化后是否存在明顯雜帶；

• Strep-tag是否完整；

• 截短結構域是否成功表達；

• 全長蛋白是否保留預期結構區域。

圖5：eProtein Discovery系統放大生產結果。

九、表達篩選結果：可溶性標簽與無細胞混合體系的影響

eProtein Discovery系統在TF L全長蛋白、L2結構域及L3結合結構域的表達與純化中展現出較高篩選效率。系統在24小時內篩選192組表達條件，并生成30組可純化性數據，從而快速確定可溶性功能性TF L變體的優選制備條件。

在篩選出的Top30表達條件中，所有構建體均含可溶性標簽，說明可溶性標簽在獲得可溶性及可純化蛋白方面發揮了關鍵作用。

具體結果包括：

• 全長TF L和L2采用P17可溶性標簽；

• L3采用CUSF標簽；

• 與無可溶性標簽構建體相比，蛋白表達量提升1.83倍。

這一結果說明，對于復雜轉錄因子這類難表達蛋白，可溶性標簽不僅是純化輔助工具，也可能直接影響蛋白折疊路徑、可溶性表達比例和最終可純化得率。

圖6：TF L變體的表達與純化結果。

十、Zn2?與氧化還原體系對TF L表達的影響

除可溶性標簽外，無細胞混合體系的組成也顯著影響表達結果。每個優選體系均含Zn2?，這對穩定TF L中富含半胱氨酸的鋅結合區域十分重要。

添加GSSG后，全長TF L蛋白表達量提升約11%。而PDI?與GSSG組合對L2和L3的提升更明顯：

• L2表達量提升75%；

• L3表達量提升47%。

GSSG和PDI?/GSSG提供的氧化環境，可幫助維持半胱氨酸殘基的氧化還原狀態，支持蛋白正確折疊。雖然TF L本身不含典型二硫鍵，但合適的氧化還原環境仍能減少異常相互作用，例如半胱氨酸錯配、非特異性聚集或結構域不穩定。

對于LIM結構域這類富含半胱氨酸、依賴金屬離子配位的區域，Zn2?和氧化還原條件的組合尤為關鍵。若氧化還原環境不合適，可能影響半胱氨酸狀態，進而影響鋅離子配位和結構域穩定性。

這一結果說明，無細胞蛋白合成體系并不是簡單“表達蛋白"，而是可以通過反應體系設計，針對目標蛋白的結構特性進行定制化優化。

十一、EMSA實驗：驗證蛋白DNA結合功能

獲得可溶性蛋白并不代表蛋白一定具備正確功能。因此，本案例進一步采用DNA結合電泳遷移率變動分析（EMSA）評估蛋白的DNA結合能力，并驗證其折疊狀態。

實驗設計如下：

1. 使用放大生產獲得的TF L變體；

2. 與Atto 488標記的雙鏈DNA共同孵育；

3. 該雙鏈DNA由含TF L結合位點的單鏈DNA退火獲得；

4. 樣品在4–16%天然凝膠中電泳；

5. 通過與游離DNA探針對比評估遷移率變化；

6. 設置含突變TF L結合位點的陰性對照驗證結合特異性；

7. 對全長TF L設置三個濃度梯度，觀察蛋白濃度對DNA-TF L復合物形成的影響。

結果顯示，全長TF L與含結合位點的Atto 488標記DNA探針呈濃度依賴性結合，在天然凝膠上出現清晰遷移率變化。L3結合結構域也能夠與DNA探針形成復合物，而含突變結合位點的陰性對照無明顯結合，證實相互作用具有特異性。

值得注意的是，L2結構域未與DNA結合，提示其可能承擔非DNA結合相關的結構或調控功能。這一結果也符合結構域功能拆分的實驗邏輯：L3更可能直接參與DNA結合，而L2可能參與蛋白穩定、構象調節、復合物形成或其他調控活動。

圖7：DNA結合EMSA實驗結果。（A）不同濃度全長TF L與含TF L結合位點的Atto 488標記雙鏈DNA孵育后，經天然凝膠分析的結果；采用含突變TF L結合位點的陰性對照探針驗證結合特異性。（B）TF L未知功能結構域L2及結合結構域L3的DNA結合能力評估結果。

十二、從案例看無細胞系統的技術價值

從TF L案例可以看出，無細胞蛋白合成體系的價值不只是“縮短表達時間"，更重要的是能夠把表達優化過程變成可數據化、可組合篩選的系統工程。

對于復雜蛋白而言，傳統表達體系經常需要逐一嘗試不同載體、菌株、誘導溫度、培養基、表達時間和純化條件，周期較長且試錯成本高。而無細胞系統可以直接圍繞構建體、標簽和反應體系進行并行篩選，快速判斷哪一類組合更適合目標蛋白。

其優勢主要體現在：

1. 篩選速度快：短時間內完成多組條件并行比較；

2. 變量可控：添加劑、標簽和構建體均可系統設計；

3. 適合復雜蛋白：對折疊困難、易聚集、結構域復雜蛋白更友好；

4. 可直接連接功能驗證：放大后蛋白可用于EMSA等下游實驗；

5. 有助于減少盲目試錯：通過數據確定優選表達策略；

6. 適配藥物研發早期階段：可更快獲得靶蛋白用于結構、功能或篩選研究。

十三、結論

無細胞蛋白合成體系為復雜蛋白制備提供了一種高效、靈活且可調控的技術路徑。通過eProtein Discovery這類高通量蛋白表達篩選系統，研究者可以在較短時間內系統評估DNA構建體、可溶性標簽、無細胞混合體系和添加劑組合對蛋白表達、純化及功能活性的影響。

在添加劑優化方面，金屬離子、有機輔因子、分子伴侶和氧化還原調節劑可分別針對不同類型蛋白發揮作用；在TF L案例中，可溶性標簽、Zn2?以及GSSG/PDI?體系共同改善了復雜轉錄因子的表達與純化表現，并通過EMSA實驗驗證了蛋白保留DNA結合功能。

對于金屬結合蛋白、含半胱氨酸結構域蛋白、轉錄因子、膜蛋白、易聚集蛋白及其他傳統體系難表達蛋白，無細胞系統不僅能夠提高表達篩選效率，也能為后續功能驗證和藥物研發提供更高質量的蛋白樣品。

本文基于cell-free、無細胞蛋白表達、無細胞蛋白合成的應用文章、文獻等公開技術資料由中國無細胞蛋白表達相關應用解決方案提供商上海曼博生物整理，僅用于科研信息分享。上海曼博生物可提供eProtein Discovery高通量無細胞蛋白表達篩選系統、cell free system蛋白表達解決方案及復雜蛋白制備相關產品與技術支持。也可掃描下方圖片咨詢無細胞蛋白表達方案提供商上海曼博生物。