Sexton人血小板裂解液nLiven PR對T細胞擴增與TCM表型影響解析

一、前言

T細胞療法包括CAR-T和TCR-T等已成為一種高效的新型治療腫瘤尤其是血液瘤的方法。以往細胞治療的治療劑量是根據呈遞相關表面抗原的細胞總數來計算的，希望這些細胞的部分群體能夠在移植到病人體內表現出持久的效應反應。最近的研究表明呈現中央記憶表型的T細胞在多種疾病模型中會提高效應表型的療效[文獻1]。

如圖1所示，TCM是中央記憶型T細胞（Central Memory T cell）的簡稱，是初始T細胞（Naive T Cell）經過抗原激活后，產生的具有長期記憶性的，并能夠歸巢到淋巴結接受抗原再刺激的T細胞。被激活的TCM細胞，在抗原的再次刺激之下，可繼續產生大量的攜帶同種抗原的克隆化的效應記憶型T細胞。因此TCM細胞因其歸巢性、記憶性、持久性以及擴增性等抗腫瘤的特點，相對于以效應T細胞為主成分的免疫細胞治療生物制品具備一定的預防/抗腫瘤和治療腫瘤雙重作用的優勢。

圖1 中央記憶T細胞TCM的分化由來

免疫治療用細胞體外培養體系尤其是培養基補充劑的可持續性穩定供應是諸多生物醫藥企業密切關注的問題之一。細胞治療行業的迅速發展給傳統的細胞培養物料的傳統供應鏈帶來了壓力，胎牛血清作為一種動物衍生試劑在監管方面存在重大問題，因此研究人員在很大程度上依賴于人類 AB血清作為一種特殊的蛋白質、激素和細胞因子混合的補充來源，以此促進T細胞制造過程中的生長。然而人AB血清除了本身原材料對于供體選擇的限制性問題，在能否保持細胞特定表型或重要特性的情況下能否比FBS更能促進細胞增殖的作用是有爭議的[文獻2]。

人血小板裂解液Human Platelet Lysate （hPL)是作為胎牛血清、人AB血清的替代性的培養基補充劑，hPL是將人的血小板進一步裂解后所獲得的液體成分，其中含有多種生物活性因子（如圖2）。

圖2 血小板裂解液hPL組成成分

日立先進治療方案公司(HCATS)和美國Sexton生物技術公司合作將人血小板裂解液nLiven PR與人AB血清(ABS)作為兩種免疫細胞治療用細胞培養基補充劑在對T細胞記憶表型和細胞擴增性能影響差異進行了小規模評估，以期研究如何幫助細胞治療的生物醫藥企業提高細胞治療用的細胞質量和增加細胞穩定供應。

二、T細胞培養擴增以及TCM表型實驗

1、hPL與ABS對細胞擴增群體效果比較

從兩個供體獲得外周血單個核細胞(PBMCs)，用CD3/CD28 T細胞激活劑后在靜態培養瓶條件下培養14天?？偟膩碚f，在培養第8天時總PBMCs細胞數擴增沒有明顯變化，然而在第10天使用nLiven PR的培養組在兩個供體中都顯示出明顯高于ABS的擴增效果（圖3）。并且對于第8天細胞樣本進行的FACS分析，其中nLiven PR組中CD3+細胞亞群比例增加到98.2% ± 0.24%（供體1） 和 97.6± 0.26%（供體2），而ABS組CD3+細胞亞群比例分別為94.8%±0.63%和91.9%±1.47%。因此可初步大致判斷nLiven組相對ABS組的PBMCs總擴增群體增加的原因是由于T細胞亞群為主擴增的促進。

圖3：兩名捐贈者的 PBMCs 在以 ABS 和 hPL 作為培養補充劑的擴增對比

培養10天后均實現了統計學上顯著的擴張

2、hPL與ABS對細胞擴增時TCM細胞亞群影響的比較

在前言中，我們已知TCM的定量化的監測為臨床規范化治療提供參考指標，通過細胞制劑中最終TCM亞群而不是總T細胞產量來評估培養效果提供更現實的治療相關性參考，因此可以說良好TCM表型的T細胞群體也是評估細胞治療制劑的產量有效且重要的參考方面。

一般而言TCM細胞亞群的百分比通常與細胞群體翻倍的次數呈負相關（如圖4中的ABS培養組），然而當在靜態培養瓶中用nLiven PR培養時，與ABS組相比雖然實驗中細胞總產量相似但是該TCM亞群細胞在統計上有顯著增加(見圖4)，由此推斷nLiven PR條件下生產的高質量、有效的TCM細胞數量更多。這也再次驗證了實驗1中得出的結論：無論不同的供體PBMCs中TCM的起始濃度百分比是多少，14天培養期結束時有大約30%的T細胞群體為TCM（起始細胞為PBMCs） ，但同樣利用ABS培養的 PBMCs擴增的同時則會導致TCM群體顯著減少。

圖4：來自6個獨立供體實驗的數據在靜態培養瓶中擴增顯示

nLiven PR在培養14天后持續增加PBMCs中總的中央記憶T細胞比例

下圖5種展示的是起始細胞選用來自三個供體的CD3+陽性的細胞，在結束培養期時約50%的T細胞亞群為TCM。nLiven組與ABS組相比，兩名供體的PBMCs細胞培養后TCM細胞亞群有統計學意義的顯著增加。

圖5：三個供體的CD3+陽性的細胞用hPL和AB血清擴增后TCM的比例

用nLiven PR培養的T細胞在體外擴增實驗中，其TCM細胞亞群的增加結果趨勢是明確且保持一致的，這與添加AB血清培養獲得的T細胞包括增效果隨之而來的TCM亞群比例降低的這種現象即原代人T細胞擴增的驅動向效應表型分化的預期相反，這表明nLiven PR的作為T細胞培養基補充劑的加入有選擇性地促進了在整個體外培養過程中TCM表型的維持。

3、hPL與ABS對T細胞治療起始材料差異性影響的比較

緊接著研究人員在放大的攪拌培養系統中評估使用nLiven替代ABS作為培養補充劑的持續影響，主要操作是：對于來自三個供體的CD3+起始細胞亞群，用Dynabeads-Activator CD3/CD28 激活處理后，在攪拌式生物反應器中培養11天。發現nLiven PR和ABS兩組的所有三個供體的平均細胞群的翻倍分別為6.1±0.58和6.0±1.37 (圖6)。因此該實驗中nLiven和ABS兩組總T細胞群體擴增沒有統計學上的顯著變化。然而當關注到這三組間供體來源起始細胞群體CD3+之間的差異性，nLiven PR組的變異系數為10%，而ABS組為23%，由此表明nLiven PR組的供體間變異顯著降低，后面的實驗也在這兩組不同供體間的對比實驗發現nLiven血小板裂解液作為培養基補充可能會緩解因血小板捐贈供體之間差異性帶來的整體治療的差異性影響，降低起始材料的可變性，幫助開發者產生更好的特征治療。

圖6：3組供體來源的T細胞擴增在ABS和hPL兩種組影響區別不大

但nLiven PR組的供體對供體變異顯著較低

如何降低批次之間的差異是開發細胞治療制品一個主要考慮因素，作為人類血小板的裂解物nLiven比富集的人AB血清在生產制備工藝過程中涉及生物化學物質的更為均勻的混合。這種差異可能是帶來細胞治療用細胞培養產生更為一致反應的原因之一。

三、結語

本次研究多個供實驗中，nLiven PR的培養組中TCM表型得到促進即在PBMCs擴增的TCM細胞亞群顯著增加。而對于細胞制品轉化為臨床時關注的捐贈供體的一致性影響方面：與ABS相比，當nLiven PR補充培養基進行與商業相關的細胞培養擴增實驗時，不同供體間獲得的總細胞產量或中央記憶表型TCM的變異水平較低。從細胞制劑中所用治療用細胞質量的屬性，而不是細胞數量的體積來評估產量方面，我們可以得出：nLiven 將PR應用到T細胞體外細胞制品的制造過程中可以獲得高質量的治療用T細胞。

此外美國貝勒醫學院由 Norihiro Watanabe利用胎牛血清(FBS)、人AB血清(ABS)和人血小板裂解液nLiven作為培養基補充劑對T細胞記憶表型和治療療效的影響進行了小規模評估，最終結果顯示：對比ABS和FBS，在nLiven中培養組實驗中，表現出中央記憶表型的T細胞和總存活率在統計上顯著增加（圖7）[文獻3]。

圖7：相對于FBS和ABS，Sexton血小板裂解液T-Liven的擴增效率更高，更有助于T細胞維持較低的分化水平狀態

美國Sexton公司無動物源無需添加肝素的人血小板裂解液,既提供經典的Stemulate滿足干細胞治療用戶科研和臨床以及GMP生產需求，又針對免疫細胞治療提供病原體去除（Pathogen Reduced,PR）工藝的臨床級nLiven和袋裝封閉系統T-Liven血小板裂解液產品。滿足質量和監管要求且已在FDA已經備案藥物主文件，是全球臨床干細胞和免疫治療應用中用作高性能FBS/ABS替代品。

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四、參考文獻

1.Klebanoff CA, Gattinoni L, Torabi-Parizi P et al. Central memory self/tumor-reac-tive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. PNAS 2005; 102 (27): 9571–6.

2.Manufacturing of primed mesenchymal stromal cells for therapy. Nature Biomedical Engineering,2019. 3(2): 90-104.

3.Torres Chavez A, McKenna MK, Canes?trari E et al. Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity. J. ImmunoTher. Cancer 2019; 7: 330.

本文基于Sexton公開資料由其中國直售提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享。上海曼博生物可提供Sexton人血小板裂解液、nLiven PR、T-Liven血小板裂解液及細胞治療培養基補充劑相關產品與技術支持，支持T細胞培養、免疫細胞治療及細胞治療工藝開發應用。

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