ELISpot是檢測和量化能分泌特定細胞因子（如IFN-γ, IL-2, IL-4等）的免疫細胞（尤其是T細胞）的極其靈敏的技術。在PBMC中使用ELISpot，主要用于評估針對特定抗原
（如病毒抗原、腫瘤抗原、疫苗候選抗原）的T細胞免疫反應。
ELISpot的原理類似于夾心法ELISA，但是在固相板（PVDF膜或硝酸纖維素膜）上進行。其基本過程是：
包被抗體：在96孔板底部包被能捕獲目標細胞因子的特異性抗體。
細胞刺激與孵育：加入PBMC和刺激物（抗原），在37°C CO?培養箱中孵育（通常16-48小時）。如果T細胞能識別該抗原，就會被激活并分泌細胞因子。
細胞因子捕獲：分泌的細胞因子立即被板底包被的抗體捕獲在細胞周圍。
檢測：洗去細胞后，加入生物素化的檢測抗體，隨后加入酶標記的鏈霉親和素。
顯色：加入底物，在酶的作用下，在細胞因子被捕獲的位置產生不溶性的有色斑點。
計數：每個斑點代表一個曾分泌該細胞因子的抗原特異性T細胞，通過ELISpot讀板機或顯微鏡對斑點進行計數。
試劑與材料：
商業化的IFN-γ ELISpot試劑盒（通常包含包被好的板子或包被抗體、檢測抗體、酶聯物、底物等）
RPMI-1640培養基（含10% FBS, 1% 青霉素-鏈霉素，L-谷氨酰胺）
待測抗原：例如病毒肽段庫（peptide pools）、重組蛋白、陽性對照（如PHA或PMA/Ionomycin）、陰性對照（培養基或無刺激劑）
PBMC樣本（新鮮分離或液氮凍存后復蘇的）
無菌PBS、胎牛血清（FBS）、T細胞培養用添加劑等
PBMC的準備：
新鮮分離：使用Ficoll密度梯度離心法從外周血中分離PBMC。
凍存細胞復蘇：從液氮中迅速取出凍存的PBMC，在37°C水浴中復蘇，用預溫的培養基洗滌兩次，重懸并計數。
調整細胞濃度至 1-4 x 10? cells/mL（最終每孔通常接種2-20萬個細胞，需預實驗優化）。
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| 全自動酶聯免疫斑點分析儀 |
板子預處理：
如果使用預包被板，直接進行下一步。
如果自行包被，用抗人IFN-γ包被抗體4°C過夜包被板子，然后用PBS洗板3次，再加入含10% FBS的培養基在37°C封閉至少1小時。
配制刺激物：
用培養基將抗原（如肽段庫）稀釋到所需工作濃度（通常終濃度為1-10 μg/mL/肽段，需優化）。
配制陽性對照（PHA通常1-5 μg/mL）和陰性對照（培養基）。
加樣與刺激：
實驗孔：抗原
陽性對照孔：有絲分裂原（PHA等）
陰性對照孔：培養基
吸棄板中的封閉液。
按實驗設計向孔中加入刺激物（每孔50-100 μL）：
向各孔中加入準備好的PBMC細胞懸液（每孔50-100 μL）。注意：設置復孔（至少3個）以減少誤差。
輕輕晃動板子混勻，放入37°C，5% CO?培養箱中孵育 16-24小時（孵育時間需優化）。
孵育后洗滌與檢測：
小心吸棄細胞和培養液。
用預冷的去離子水或PBS洗板4-6次，以CHE底去除細胞。最后一次可在扣干在吸水紙上用力扣干。
加入生物素化的檢測抗體（按試劑盒說明稀釋），室溫孵育1-2小時。
洗板4-6次。
加入酶聯 Streptavidin（如HRP-Streptavidin），室溫孵育1小時。
洗板4-6次。
顯色：
加入新鮮配制的底物溶液（如AEC或BCIP/NBT）。
在室溫避光條件下顯色，直至斑點清晰可見（通常5-30分鐘）。
當斑點發育良好時，用去離子水沖洗板子終止反應。
將板子倒置，在通風處自然晾干。
斑點計數與分析：
使用Bioreader的ELISpot讀板機進行掃描和計數。
質控標準：
陽性對照孔：必須有大量、清晰的斑點，否則說明實驗系統或細胞活性有問題。
陰性對照孔：背景應該非常干凈，斑點很少（通常<10個斑點/孔）。高背景意味著非特異性結合嚴重。
結果計算：
計算抗原孔和陰性對照孔的平均斑點形成細胞數（SFCs/10? PBMC）。
抗原特異性反應 = (抗原刺激孔平均SFC) - (陰性對照孔平均SFC)
通常認為，當 (抗原孔SFC) > 2倍 (陰性對照孔SFC) 且 (抗原孔SFC - 陰性對照孔SFC) > 10-20 SFC/10? PBMC 時，可判定為陽性反應。
表示方法：
結果通常以 每百萬個PBMC中抗原特異性的斑點形成細胞數（SFC/10? PBMC） 來表示。
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