GFP轉基因擬南芥的培養及熒光觀察

實驗原理：
1.GFP報告基因
 全稱為綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀60年代在水母中發現的發光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光，用于蛋白質在活細胞中的準確定位及動態變化觀察（分泌蛋白的分選、亞細胞定位）
2.目的基因
MAP65-1，是一種微管結合蛋白，可以根據擬南芥葉片表皮細胞、保衛細胞，下胚軸和根部細胞中微管骨架的分布情況來推斷目的基因是否存在。
3.表達載體：
植物表達載體的構建→導入農桿菌自我復制→浸染花粉轉入擬南芥； 卡那霉素抗性培養基篩選，
卡那霉素:
抗生素
影響植物細胞葉綠體和線粒體的蛋白合成,引起植株黃化死亡.卡那霉素能對轉基因植物進行篩選實質上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來。

GFP轉基因植株 野生型植株 GFP轉基因植株 轉基因植株
1/2MS培養基 1/2MS卡那抗性培養基

實驗材料：
GFP轉基因擬南芥種子及野生型種子；1/2MS培養基 ；1/2MS卡那抗性培養基； 75％乙醇；10％NaClO；無菌水。

實驗步驟：
1.種子春化（ 加蒸餾水放入4℃冰箱中過夜）；
2.751min（混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
3.10％xiaodu10min （混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；
4. 無菌水洗三遍，用牙簽將種子點在培養基表面（每皿4-5顆種子 盡量均勻）；
5.封膜，做好標記，平放于培養架上培養。

實驗結果：
少等長勢不優良的現象，是因為野生型不存在卡那抗性基因，而轉基因植株存在卡那抗性基因，所以可以將轉基因植株在卡那抗性培養基中篩選出來；在轉基因擬南芥中，熒光標記在不同位置亮度效果不同，我們認為可能是與不同位置微管分布情況和微管結合蛋白對不同位置的結合效果不同有關。

注意事項：
嚴格無菌操作.
xiaodu過程動作要快.
槍頭不要重復使用，物品不要拿出超凈臺.
點種時每個位置盡量只點一顆子.
操作時盡量避免說話和人員走動.
注意小組內的配合和小組間的協調.

思考題：
1 .本實驗用的了兩種培養基，有何不同？主要作用是什么？
 實驗中分別用到了1/2MS培養基和1/2MS卡那抗性培養基。MS培養基是一種常用的植物組織培養基；在1/2MS培養基中無機鹽為MS培養基的一半。但在1/2MS卡那抗性培養基中添加了一種抗生素—卡那霉素。卡那霉素能對轉基因植物進行篩選實質上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉化體就很容易從非轉化體中篩選出來。
2.什么是GFP? 在生物學研究中有何用途？
GFP是綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP），簡稱GFP，20世紀60年代在水母中發現的發光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光，可以起到標記目的基因的作用。
3.GFP主要使用什么顏色的激發光？你觀察到得熒光是什么顏色？
GFP在藍光或紫外光激發下發出綠色熒光、

標注：

在植物分子生物學研究中，綠色熒光蛋白（GFP）作為報告基因，被廣泛應用于目的基因的亞細胞定位和轉基因植株的陽性篩選。本文以擬南芥為模式植物，介紹從種子消毒、抗性篩選到活體熒光觀察的完整實驗流程。

1. 實驗原理

GFP（Green Fluorescent Protein）源自維多利亞多管水母，是由238個氨基酸組成的單鏈多肽，在藍光或紫外光激發下可發出綠色熒光。實驗中，我們將微管結合蛋白基因 MAP65-1 構建至植物表達載體，通過農桿菌介導法轉入擬南芥。利用 卡那霉素抗性基因 作為篩選標記，在含卡那霉素的培養基上，未轉化的野生型植株因蛋白合成受阻而黃化死亡，轉化植株則能正常生長，從而實現陽性苗的初步篩選。

2. 實驗材料

GFP轉基因擬南芥種子及野生型對照；1/2 MS培養基；1/2 MS卡那霉素抗性培養基；75%乙醇；10% NaClO；無菌水。

3. 實驗步驟

1. 
   

   春化與消毒：將種子置于無菌水中，4℃冰箱春化過夜。取出后依次用75%乙醇處理1 min、10% NaClO處理10 min進行消毒，期間需不斷混勻。

   
   

2. 
   

   清洗與播種：消毒結束后盡量吸凈液體，用無菌水清洗3遍。用牙簽將種子點播于培養基表面（每皿4-5粒，分布均勻），封膜并做好標記。

   
   

3. 
   

   培養：將培養皿置于培養架上進行垂直或水平培養，定期觀察生長情況。

   
   

4. 熒光觀察

培養一段時間后，野生型植株在卡那霉素培養基上會逐漸黃化枯萎，而轉基因陽性植株長勢良好。此時，可利用手持式熒光蛋白激發光源（如LUYOR-3415系列，選用450nm左右波段）對植株進行照射。配合專用濾光眼鏡，可在非暗室條件下直接觀察到轉基因植株發出的明亮綠光，進一步確認 MAP65-1 基因在根、下胚軸及葉片表皮細胞中的表達情況。