目前仍有超過 30% 的人類基因功能未被明確注釋，其中相當一部分被推測編碼代謝相關酶類。雖然基于體外酶活性的代謝組學篩選技術可用于發現未知反應，但其回收率普遍較低 (通常低于 20%) ，難以實現系統性覆蓋，且多數反應無法在生理環境下得到驗證。這些“缺失"的反應構成了代謝網絡中的“暗物質"，嚴重制約了我們對細胞生理及疾病機制的系統性認知^[1]。

值得關注的是，研究開發的 IsoNet (Isotopologue Similarity Networking) 策略，通過整合穩定同位素示蹤代謝組學與同位素異構體模式相似性網絡分析，可在無先驗假設的前提下，直接從活細胞及動物體內推斷并驗證未知代謝反應。該方法無需酶純化，有效規避了體外篩選的低回收率瓶頸，顯著拓展了可檢測反應的類型與范圍——包括非酶促反應。通過系統構建同位素相似性網絡，IsoNet 實現了代謝反應的高通量發現與功能解析，為繪制完整代謝圖譜、揭示代謝通路在生理與病理過程中的作用提供了*的無偏倚工具。

在代謝反應網絡中，反應步驟超過 7 步的代謝物對被定義為非反應對。原始數據以源數據文件的形式提供（圖 1）。

圖 1.在穩定同位素示蹤代謝組學中，反應相關的代謝物往往具有相似的同位素異構體模式。

A. 代謝反應相關代謝物生成示意圖及其同位素異構體模式相似性計算。B. 在用全碳13 標記谷氨酰胺或 全碳13 標記葡萄糖標記 17 小時的 293T 細胞中檢測到的標記代謝物和反應對的數量。C. 在用全碳13標記谷氨酰胺標記的 293T 細胞中，反應相關代謝物 (天冬酰胺/天冬氨酸和天冬氨酸/乳清酸) 的同位素異構體模式相似性評分 (S_ISO) (每組 n = 6 個生物學重復)。數值表示平均值 ± 標準誤。D. 在用全碳13標記葡萄糖標記的 293T 細胞中，反應相關代謝物 (谷氨酸/α-酮戊二酸和 α-酮戊二酸/順式烏頭酸)的同位素異構體模式相似性評分 (S_ISO) (每組 n = 6 個生物學重復)。數值表示平均值 ± 標準誤。E. 在用全碳13標記谷氨酰胺或全碳13標記葡萄糖標記的 293T 細胞中，反應對 (RP) 和非反應對 (non-RP) 中兩種代謝物具有高同位素異構體相似性評分 (S_ISO ≥ 0.7) 的百分比。

研究發現，在穩定同位素示蹤實驗中，具有直接生化轉化關系的底物與產物，其同位素異構體分布模式 (isotopologue patterns) 高度相似。基于此，團隊開發了同位素模式相似性評分 (S_ISO score)，并以此構建代謝物間的關聯網絡，從而在全代謝組層面無偏倚地推斷潛在代謝反應。

在 HEK293T 細胞、小鼠肝臟及誘導性骨髓來源巨噬細胞 (iBMDM) 中，IsoNet 共推斷出數百對具有高置信度的代謝物轉化關系，涵蓋氧化還原、基團轉移、水解、連接等多種反應類型。其中大量反應未被收錄于 KEGG、HMDB 或 MetaCyc 等主流代謝數據庫。

研究聚焦于谷胱甘肽 (GSH) 相關代謝網絡，發現 GSH 可通過一種新型轉硫反應 (transsulfuration)，將其半胱氨酸殘基替換為絲氨酸，直接生成新代謝物 γ-谷氨酰-絲氨酰-甘氨酸 (γ-Glu-Ser-Gly)。該結果表明，谷胱甘肽不僅是經典抗氧化劑，還可作為內源性硫供體參與代謝調控。這一發現挑戰了傳統認為 γ-谷氨酰三肽僅通過 ATP 依賴的連接酶合成的認知。

IsoNet 能夠成立的前提，是高質量的穩定同位素示蹤數據。該研究系統使用了多種碳 13 標記化合物，它們均為全碳 13 標記的化合物如：全碳 13 標記葡萄糖 (D-Glucose-¹³C₆)、全碳 13 標記谷氨酰胺 (L-Glutamine-¹³C₅)、全碳 13 標記乙酸 (Acetic acid-¹³C₂) 、全碳 13 標記絲氨酸 (L-Serine-¹³C₃)、全碳 13 標記半胱氨酸 (L-Cysteine-¹³C₃)、全碳 13 標記甘氨酸 (Glycine-¹³C₂)、全碳 13 標記的丙酮酸鈉 (Pyruvic acid-¹³C₃ sodium) 等。

這些全碳 13 標記化合物，覆蓋了糖酵解、TCA 循環、氨基酸代謝和谷胱甘肽合成等關鍵代謝通路，使研究者能夠根據碳 13 標記原子追蹤其在復雜網絡中的去向。

與傳統同位素實驗只驗證單條假設通路不同，本研究關注的是所有代謝物的同位素分布形態。只要兩個代謝物在細胞中存在直接反應關系，它們的同位素“指紋"就會呈現高度相似性，這正是 IsoNet 的邏輯基礎。這也是 IsoNet 對實驗結果做分析的重要依據。

從研究者設計的實驗操作來看，該研究為穩定同位素示蹤提供了一個可復制、可擴展的范式，也為后續的研究提供了較好的指導范例，以下為以細胞為例作者做實驗的詳細流程：

細胞系：293T 細胞、iBMDM (永生化骨髓源性巨噬細胞) 等。培養基：使用含 10% 透析胎牛血清 (dFBS) 和 1% 青霉素-鏈霉素的 DMEM。標記時機：細胞生長至 80% 匯合度時更換為含同位素標記物的新鮮培養基。標記時間：通常為 17 小時 (可根據實驗調整)。

快速移除培養基，用 PBS 洗滌細胞兩次。置于干冰上，加入預冷的代謝提取液 (甲醇/水 = 80/20，V/V) 淬滅代謝。 ?80 ℃ 孵育 40 分鐘。刮取細胞并轉移至離心管，再用 400 μL 提取液清洗培養皿，合并提取液。渦旋 1 分鐘，4 ℃、16200 × g 離心 10 分鐘，取上清。如測定半胱氨酸等易氧化代謝物，可取部分上清進行 N-乙基馬來酰亞胺 (NEM) 衍生化處理。剩余上清在真空濃縮儀中 4 ℃ 干燥，?80 ℃ 保存。

干燥樣本用 100 μL 乙腈:水 (1:1，v/v) 復溶。超聲 10 分鐘，4 ℃、16200 × g 離心 15 分鐘。取上清進行 LC-MS 分析。

原始數據經 ProteoWizard 轉換為 mzXML (MS1) 和 mgf (MS2) 格式。    使用 xcms 進行峰檢測與對齊。通過 MetDNA 進行已知代謝物注釋 (MSI Level 1-2)。未知特征峰經 CAMERA 去冗余、Genform 預測分子式。使用 MetTracer 提取標記代謝物的同位素分布。采用 Accucor 進行天然同位素校正。

A. 同位素相似性網絡構建：計算代謝物對的同位素模式相似性得分 (Siso)。結合 MS/MS 譜圖相似性 (余弦得分)。構建網絡：節點為標記代謝物，邊表示 Siso > 0.7 且 MS² 相似性 > 0.5。

B. 反應推斷與注釋：利用 KEGG 反應庫和 Delta Mass 庫匹配代謝物對的質量差 (Δm/z)。推斷反應類型 (如氧化、轉移、水解等) 及原子差異。

A. 化學標準品驗證：合成新發現代謝物 (如 γ-Glu-Ser-Gly、S-乙酰谷胱甘肽等)。通過保留時間、MS/MS 譜圖及核磁共振 (NMR) 比對確認結構。

B. 能與機制驗證：抑制劑處理：使用 BSO (谷胱甘肽合成抑制劑) 驗證代謝物與谷胱甘肽代謝通路的關聯。基因敲降：通過 siRNA 敲低 GCS (谷氨酰半胱氨酸合成酶)，觀察代謝物水平變化。體外反應驗證：在無酶體系中孵育底物 (如谷胱甘肽 + 乙酰輔酶 A)，驗證非酶促反應。分類為已知反應、I 型未知反應 (已知-未知代謝物對)、II 型未知反應 (未知-未知代謝物對)。

該實驗流程的優勢在于：無需提前設定靶點，真正實現數據驅動的反應發現。

IsoNet 解決的問題：突破“已知代謝物-已知反應"的研究邊界；將穩定同位素示蹤從假設驗證工具升級為無偏倚發現引擎；系統揭示非經典、非酶促或低豐度代謝反應。如需更多同位素標記物請參考 MCE 。

 參考文獻

 [1] Gao Y, etal. Charting unknown metabolic reactions by mass spectrometry-resolved stable-isotope tracing metabolomics. Nat Commun. 2025 May 31;16 (1):5059