一、試驗前準備

菌株與藥物準備

菌株分離純化：從臨床樣本（如痰液、血液、皮膚鱗屑）或環境樣本中分離目標真菌（如白色念珠菌、曲霉菌），在霉菌培養箱中進行純化培養（溫度設置為 25~30℃，濕度 60%~80%，避光培養 3~7 天），獲得單菌落。

藥物配置：選取臨床常用抗真菌藥物（如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素 B），配置成系列濃度梯度的藥液，稀釋至試驗所需濃度范圍（參考 CLSI 或 EUCAST 標準）。

培養基與耗材準備

選用適合真菌生長的培養基，如沙堡葡萄糖瓊脂（SDA） 或RPMI 1640 液體培養基（液體培養基更適合定量檢測）。

準備無菌 96 孔板、接種環、移液器等耗材，確保無菌操作。

霉菌培養箱參數校準

根據真菌種類設置溫度：酵母類真菌（如念珠菌）一般 35℃，絲狀真菌（如曲霉菌）一般 28℃。

調節濕度至 70% 左右，部分真菌需設置光照周期（如某些皮膚癬菌），培養箱內需定期消毒，避免污染。

二、抗真菌藥物敏感性試驗操作步驟

以微量肉湯稀釋法（CLSI M27-A4 標準，適用于酵母樣真菌）為例：

菌懸液制備

挑取純化后的真菌單菌落，接種于 RPMI 1640 液體培養基中，在霉菌培養箱中 35℃振蕩培養 2~4 小時，調整菌懸液濃度至 1×10? CFU/mL（麥氏比濁法校準）。

藥物與菌液加樣

在 96 孔板中加入系列濃度梯度的抗真菌藥液，每孔 100μL；再加入調整好濃度的菌懸液，每孔 100μL，使藥物終濃度覆蓋從亞抑菌濃度到超抑菌濃度的范圍。

設置對照組：陽性對照組（只加菌懸液，不加藥物）、陰性對照組（只加培養基，不加菌液和藥物）。

恒溫培養

將 96 孔板密封后放入霉菌培養箱，35℃恒溫培養 24~48 小時（酵母類真菌 24h，絲狀真菌 48~72h），期間避免開蓋，防止污染和藥物揮發。

三、耐藥性判定與結果讀取

抑菌濃度（MIC）測定

培養結束后，觀察 96 孔板中真菌生長情況：以無肉眼可見真菌生長的藥物濃度為該菌株的 MIC 值。

對比 CLSI 或 EUCAST 的折點標準，判斷菌株耐藥性：

敏感（S）：MIC ≤ 敏感折點，臨床治療有效；

中介（I）：MIC 在敏感和耐藥折點之間，治療反應不確定；

耐藥（R）：MIC ≥ 耐藥折點，臨床治療無效。

殺菌濃度（MBC）測定（可選）

取無生長孔中的培養液，涂布于 SDA 平板上，在霉菌培養箱中培養 24~48 小時，以殺滅 99.9% 真菌的藥物濃度為 MBC 值，輔助判斷藥物殺菌效果。

四、真菌耐藥性流行趨勢監測

菌株收集與數據統計

長期收集不同地區、不同來源（臨床 / 環境）、不同時間段的真菌菌株，統一開展藥敏試驗，記錄每株菌對不同藥物的 MIC 值和耐藥性分類。

建立數據庫，統計耐藥率（耐藥菌株數 / 總菌株數 ×100%）、MIC??（抑制 50% 菌株生長的藥物濃度）、MIC??（抑制 90% 菌株生長的藥物濃度）。

趨勢分析維度

時間維度：對比不同年份、季節的耐藥率變化，判斷耐藥性是否逐年上升；

地域維度：分析不同地區的耐藥譜差異，明確高耐藥區域；

藥物維度：統計不同抗真菌藥物的耐藥率，篩選優勢耐藥藥物種類；

菌株維度：關注特定真菌菌種（如克柔念珠菌、煙曲霉）的耐藥特征，識別新型耐藥菌株。

數據驗證與發布

對耐藥率異常升高的菌株進行基因測序，驗證是否存在耐藥基因突變（如 ERG11 基因突變與氟康唑耐藥相關）；

結合臨床用藥數據，分析耐藥性與藥物使用頻率的相關性，為臨床合理用藥和耐藥性防控提供依據。

五、關鍵注意事項

標準化操作：嚴格遵循 CLSI/EUCAST 標準，確保菌株純化、藥物濃度、培養條件的一致性，否則會導致 MIC 值偏差。

污染控制：霉菌培養箱需定期用紫外線或*消毒，操作全程無菌，避免雜菌干擾試驗結果。

質量控制：每次試驗需加入質控菌株（如白色念珠菌 ATCC 90028），驗證試驗體系的準確性。

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